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肾脏管球反馈在高尿酸诱导高血压发病中可能的机制

刘琳  
【摘要】:背景 高血压是危害人类健康的常见病,但其机制并不非常清楚,越来越多的流行病学证据提示高尿酸血症是高血压的独立危险因素,并在动物实验中观察到高尿酸与高血压的因果关系,其机制可能与肾素—血管紧张素系统(RAS)激活、内皮功能障碍及血管平滑肌病变有关,但具体的机制并不确切,且存有争议。肾脏的管球反馈(TGF)是机体调节血压和水盐平衡最重要的机制之一,致密斑(MD)感受肾小管中盐浓度的改变,通过旁分泌途径直接调节球旁器区域颗粒细胞分泌肾素和入球小动脉舒缩,直接改变肾小球对水盐的滤过率和远端小管对盐的重吸收,而RAS的活化又直接参与全身血管的舒缩功能,进一步调节血压。因此探讨高尿酸状态管球平衡的紊乱及相关血管活性物质的分泌,对于深入了解高血压的发病机制和潜在的干预位点有积极的意义。 目的 1.观察正常血压和高血压良性肾硬化患者尿酸与血压及肾脏局部肾素表达的关系; 2.建立轻度高尿酸血症小鼠早期高血压动物模型,观察高尿酸血症对管球反馈中致密斑旁分泌三大途径的影响,了解肾脏局部肾素表达及入球小动脉结构的变化; 3.在体外培养致密斑细胞中,观察尿酸对Cox-2、nNOS、ATP代谢酶的直接作用机制; 4.在A1型腺苷受体基因敲除(A1AR-/-)小鼠中,观察TGF缺失后,高尿酸诱导高血压的作用是否依然存在,及相应肾素分泌和血管病变的改变。 材料、方法与结果 一、高尿酸血症与血压及肾素表达相关性在人群中的初步观察 收集2004年至2011年在北京协和医院行肾活检的17例高血压良性肾硬化症患者及同期血压正常的19例肾小球轻微损伤患者的临床资料(血清尿酸、肌酐、血压等),免疫组化染色方法评估肾脏局部肾素表达,观察到肾小球轻微损伤患者血清尿酸与肾脏肾素表达具有显著正相关(P0.05),而良性肾硬化组尿酸与血压及局部肾素表达没有相关性。 二、高尿酸血症模型小鼠血压升高 (一)高尿酸血症小鼠模型的建立 比较2%氧嗪酸饲料喂养、250mg/kg/d氧嗪酸灌胃和500mg/kg/d氧嗪酸灌胃+0.1%尿酸水三种方法诱导C57BL/6J小鼠高尿酸血症,确定250mg/kg/d氧嗪酸灌胃能有效诱导血清尿酸水平在1w后开始升高,2w后显著升高并维持8w以上,尿酸平均升高幅度为59.8±24.3μmol/L。小鼠的一般情况、肾功能和肾脏病理大致正常。 (二)小鼠血清尿酸浓度与血压的关系 使用无创尾动脉血压监测系统定期测定小鼠血压,观察到高尿酸小鼠收缩压2w后升高至114.2±10.9mmHg,显著高于自身基线水平106.6±7.4mmHg (P=0.017),并且显著高于同期正常对照组和别嘌醇治疗组小鼠血压。相关分析提示血清尿酸水平与收缩压呈显著正相关(r=0.333,P0.001) 三、高尿酸对肾素表达调控及入球小动脉的影响 通过免疫组化方法观察到高尿酸小鼠肾脏肾素阳性球旁器区域数/肾小球数比例显著高于正常对照组和别嘌醇治疗组(31.0±6.3%比16.8±6.3%和19.1±4.7%,P值分别为0.008和0.013),免疫荧光染色也观察到类似结果。ELISA方法检测三组小鼠血清肾素浓度,未观察到统计学意义的差异。使用免疫组化方法观察到高尿酸小鼠肾皮质nNOS表达下降,但Real-time PCR没有观察到Cox-2、CD39及CD73mRNA的统计学差异。a-SMA免疫组化染色提示,高尿酸小鼠入球小动脉管壁肌层平均面积显著增加,高于正常对照组和别嘌呤治疗组(115.25±20.78μm2比81.46±18.44μm2和79.12±9.79nm2, P值分别为0.020和0.006),同时伴有管腔狭窄(39.03±4.64μm2比51.07±8.45μm2和65.25±11.78μm2,P值分别为0.030和0.005)。 四、尿酸对致密斑细胞旁分泌作用的影响 使用Real-time PCR及细胞免疫荧光染色鉴定MMDD1细胞系表达Cox-2、 nNOS阳性,符合MD细胞特征。MTS试验、台盼蓝排斥试验提示3mg/dl-18mg/dl尿酸刺激对MD细胞增殖和死亡率无影响。使用Real-time PCR和western blot方法观察到6mg/dl与12mg/dl尿酸刺激48h和72h,促进MD细胞Cox-2表达上调,nNOS表达下降。6mg/dl尿酸刺激48h和72h均可促进CD39、CD73mRNA表达上调,而12mg/dl尿酸刺激后CD39、CD73mRNA则与正常对照无显著差异。Western blot方法观察到MD细胞表达尿酸转运子URAT1,使用苯溴马隆抑制URAT1,观察到6mg/dl尿酸刺激对CD73mRNA的上调作用被阻断。 五、腺苷及A1AR在高尿酸血症所致高血压机制中的作用 引进A1AR基因敲除杂合子C57BL/6J小鼠进行配种、繁殖、基因鉴定。在A1AR-/-小鼠中复制高尿酸血症模型,观察到A1AR-/-小鼠血清尿酸升高与野生型小鼠无差异,但收缩压并不升高(P0.05)。ELISA方法检测A1AR-/-小鼠血清肾素水平与野生型无显著差异。腹腔注射呋塞米1小时后,观察到A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压从99.2±13.8mmHg升高至113.7±19.4mmHg, P=0.005,而野生型高尿酸小鼠、A1AR-/-正常尿酸小鼠收缩压均无变化。2周低盐饮食慢性刺激肾素分泌实验中,A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压仍低于野生型高尿酸小鼠。a-SMA免疫组化染色提示,A1AR-/-高尿酸小鼠入球小动脉管壁肌层面积与野生型正常尿酸小鼠无异,未出现野生型高尿酸小鼠的入球小动脉管壁增厚现象。 结论 在本实验条件下观察到: 1.血压正常的肾小球轻微损伤患者血清尿酸与肾脏局部肾素表达存在显著的正相关; 2.氧嗪酸灌胃可诱导C57BL/6J小鼠血清尿酸持续升高、收缩压升高和肾脏局部肾素表达升高,长期高尿酸导致入球小动脉平滑肌增厚。 3.尿酸能直接刺激体外培养的致密斑细胞系三条旁分泌途径活化,表现为Cox-2表达升高、nNOS表达下降、CD39、CD73表达升高,尿酸对CD73的影响可能通过尿酸转运子(URAT1)介导。 4. A1AR-/-小鼠高尿酸血症并不升高血压,也不伴有入球小动脉管壁平滑肌增厚。急性肾素刺激实验可引起A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压显著升高,低盐慢性刺激肾素分泌并不能改变A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压,说明腺苷及A1AR可能在高尿酸导致高血压发病机制中起到关键作用。


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