1、EMT相关的LncRNA筛选及功能和机制研究2、Gadd45α对自噬的调控及分子机制研究

【摘要】：长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是广泛存在于哺乳动物细胞中的一类蛋白非编码序列,通常由RNA聚合酶Ⅱ转录形成,长度超过200nt。由于缺少有效开放阅读框,很少编码或不能编码蛋白。LncRNA能够通过不同的作用机制,如RNA-RNA碱基配对,RNA-蛋白相互作用,RNA-DNA相互作用等,在基因表达调控的各个层面发挥功能,参与染色质修饰、转录调节、剪切加工、RNA稳定性调节等重要过程。研究发现,LncRNA与一系列重大疾病相关,其中以神经性疾病和肿瘤最为突出。 EMT即上皮细胞间质转化,是指上皮细胞失去上皮表型转化为间质细胞的复杂过程,在这个过程中,上皮细胞失去自身极性、细胞间连接、获得运动能力,发生EMT的细胞可以离开上皮组织侵入周围组织或向更远端的位置转移。越来越来多的研究表明,EMT在肿瘤的侵袭转移中发挥重要功能,肿瘤细胞通过EMT过程可以侵入周围组织,并通过循环系统的运输,发生远端转移。TGFβ可以通过一系列的信号通路活化EMT相关的转录因子,因此用TGFβ处理细胞可以发生瞬时的EMT过程。 与肿瘤侵袭迁移相关的LncRNA已有报道但与EMT相关的LncRNA还鲜有报道。在本研究中,我们首先建立了TGFβ1诱导的EMT模型。通过LncRNA芯片对该模型进行分析,筛选EMT相关的LncRNAs。芯片结果显示总共有1383条LncRNAs发生变化,其中表达上调的有722条,表达下调的有661条。按照一定的筛选原则包括变化倍数、表达丰度以及启动子分析等,对其中的23条序列进行Real-time PCR验证,通过多次验证最后选择LncRNA14作为研究目标。LncRNA14位于CDH4基因的3’-UTR区,我们通过Northern blot验证了独立序列的存在。进一步对其功能进行研究发现,无论是瞬时转染还是稳定高表达细胞系,LncRNA14均可以抑制肿瘤细胞的生长和侵袭迁移能力,并明显抑制其克隆形成能力。初步的机制研究发现,过表达LncRNA14能够上调E-cadherin的表达,同时抑制vimentin的表达,提示LncRNA14可能通过经典的通路调控EMT过程。 综上所述,本文通过芯片筛选了一系列与EMT相关的LncRNAs,并通过Real-time PCR进行了验证。研究发现LncRNA14可以抑制肿瘤细胞的侵袭迁移以及克隆形成等,并对其具体的分子机制做了初步的探索。 Gadd45a是一种重要的抑癌基因,可被多种应激损伤因素诱导表达,包括：紫外照射、电离辐射、血清饥饿、化疗药物作用等。Gadd45a可诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA损伤修复以及抑制血管形成等。 自噬是广泛存在于真核生物中的一种溶酶体依赖的降解途径,是细胞存活,生长,分化和内稳态平衡不可缺少的机制。自噬可以通过降解衰老、损伤细胞器和长半衰期蛋白维持细胞稳态,同时也可吞噬细胞内微生物病原体行使天然免疫功能。研究发现,在肿瘤的发生发展中,自噬起着重要的作用。不同肿瘤类型,肿瘤发生、发展的不同阶段,自噬发挥的作用会有所不同。一方面在某些肿瘤的发生过程中,自噬起到抑制肿瘤发生的作用。另一方面一些肿瘤细胞存在高活性的自噬作用,肿瘤细胞利用自噬机制对抗由于快速分裂和供血不足引起的营养缺乏和缺氧。此外,在肿瘤化疗、放疗后,自噬活性增强,以清除因电离辐射、细胞毒性而受损的大分子或细胞器,阻断了线粒体的凋亡信号通路,抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤成活。 但是Gadd45a作为一种抑癌基因是否通过自噬过程调控肿瘤的发生发展,现在还没有相关的报道。本研究通过western blot以及免疫荧光实验在6株不同的细胞系中证实,Gadd45α(?)够明显降低细胞内Lc3-Ⅱ的表达和自噬小体的数量。同时在Gadd45a敲除的小鼠中也得到一致的结果。Bafilomycin A1处理细胞发现,Gadd45a主要通过调控自噬小体的形成抑制自噬过程。进一步对其机制进行研究发现,Gadd45a可以影响Beclinl与Vps34的相互作用,从而抑制自噬。通过免疫共沉淀以及GST pull-down实验发现,Gadd45a与Beclin1相互作用从而解离了Beclin1与Vps34的相互作用。片段化实验表明,Gadd45a主要是通过71-81位氨基酸与Beclin1结合。进一步验证试验发现,敲降Beclin1可以消除Gadd45a过表达或敲降引起的自噬的改变。 综上所述,Gadd45α可以抑制自噬过程,这种调控主要是通过上游抑制自噬小体的形成实现的。Gadd45α可以与Beclinl相互作用,从而解离了Beclin1与Vps34的相互作用。