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Hedgehog信号通路在肝纤维化小鼠模型中的作用及药物干预探索

章丽娜  
【摘要】:第一部分Hedgehog信号通路在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中的动态表达 [背景与目的]肝纤维化是各种原因引起的持续性肝损伤共有的病理阶段,其特点为大量纤维增生并伴有纤维降解的相对或绝对不足,细胞外基质沉积,最终可进展演变为肝硬化。肝纤维化的形成是一个由多种细胞介导,多种细胞因子共同参与的复杂病理过程。最新的研究显示Hedgehog (Hh)信号转导通路在肝纤维化的发生发展中可能起重要作用。本实验旨在研究Hh信号通路在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中肝纤维化不同阶段的表达情况。 [方法]7到8周雄性C57BL/6J小鼠32只,随机分为正常对照组(n=12),肝纤维化模型组(n=12),及肝纤维化自发逆转组(n=8)。腹腔注射0.8ml/kg的CCl4,每周两次,复制肝纤维化模型。自发逆转组于第4周末停用CCl4并正常饲养2周,建立肝纤维化自发逆转模型。分别于第3周、第6周收集各组小鼠肝脏、血清标本。HE染色及Masson染色评估造模不同时期小鼠的肝纤维化病变程度。比较各组小鼠肝脏生化指标及羟脯氨酸(Hyp)含量。免疫组化、免疫印迹和实时定量PCR法分析各组小鼠肝组织Hh通路的配体Shh,核转录因子Gli1, Gli2,及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。 [结果]CCl4腹腔注射3周后,肝纤维化模型组小鼠肝脏出现肝细胞变性坏死,肝小叶结构紊乱,中央静脉周围及汇管区纤维沉积增多。CCl4腹腔注射6周后,肝纤维化模型组小鼠肝脏的以上病变程度较第3周加重。自发逆转组小鼠在停用CCl4两周后,肝细胞变性坏死减少,中央静脉周围及汇管区纤维组织减少。造模第3周、第6周时,肝纤维化模型组小鼠的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBil)及Hyp均明显高于正常对照组小鼠(P0.01),其中造模6周时的ALT、TBil、Hyp显著高于造模3周时(P0.05)。自发逆转组小鼠ALT、AST、TBil及Hyp水平与造模6周的肝纤维化模型组小鼠相比均显著下降,与造模3周的肝纤维化模型组小鼠相近。免疫组化显示,相比正常对照组,造模3周、6周的肝纤维化模型组小鼠肝脏Shh,Gli1,Gli2,α-SMA的表达均明显增高,且Shh与α-SMA阳染细胞的分布位置相似,均为汇管区、纤维间隔及增生的胆管周围,而Glil与Gli2阳性染色的分布位置相似,均为汇管区,小叶间静脉周围。自发逆转组小鼠肝脏Shh, Gli1, Gli2, α-SMA阳性染色的细胞数目较造模6周的肝纤维化模型组减少,接近于造模3周时水平,甚至更少。免疫印迹和实时定量PCR显示,造模3周、6周的肝纤维化模型组小鼠肝脏Shh, Gli1, Gli2, α-SMA在mRNA及蛋白水平表达均显著高于正常小鼠,自发逆转组小鼠肝脏Shh, Gli1, Gli2, α-SMA在mRNA及蛋白水平表达较造模6周的肝纤维化模型组显著减少。 [结论]雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射0.8ml/kg的CCl4,每周两次,可成功复制肝纤维化模型。造模6周对比造模3周,小鼠肝纤维化程度更重。造模4周后撤去CCl4注射,小鼠肝纤维化可发生自动逆转,恢复至造模3周时水平,甚至程度更轻。Hh信号通路在正常小鼠肝组织中处于抑制状态,在肝纤维化模型中被异常激活,且随着肝纤维化的进展,Hh信号通路活化程度增加,随着肝纤维化的自动逆转,活化程度减轻。Hh信号通路的异常激活可能对肝纤维化的发生发展起重要作用。 第二部分环巴胺及姜黄在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中的预防和治疗作用 [背景与目的]环巴胺是Hedgehog (Hh)信号转导通路的特异性抑制剂,目前的研究显示,抑制Hh信号通路的异常活化可能有助于改善肝纤维化。姜黄有抗炎、抗氧化和抗纤维化活性,动物实验的结果提示姜黄可预防肝纤维化,但对于已经形成明显纤维化的肝组织是否有保护作用尚有争议。本实验旨在研究环巴胺及姜黄是否可以减轻CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠的肝纤维化程度,并研究其治疗机制是否为通过抑制Hh信号通路的活化所致。 [方法]7到8周雄性C57BL/6J小鼠72只,随机分为正常对照组(n=12),肝纤维化模型组(n=12),低剂量环巴胺预防组(n=8),高剂量环巴胺预防组(n=8),姜黄预防组(n=8),低剂量环巴胺治疗组(n=8),高剂量环巴胺治疗组(n=8)及姜黄治疗组(n=8)。腹腔注射0.8ml/kg的CCl4,每周两次,复制肝纤维化模型。低剂量环巴胺预防组、高剂量环巴胺预防组及姜黄预防组在开始注射CCl4的同时,分别给以环巴胺5mg/kg/d,环巴胺10mg/kg/d腹腔注射,姜黄400mg/kg/d灌胃治疗3周。低剂量环巴胺治疗组、高剂量环巴胺治疗组及姜黄治疗组在CCl4造模3周后,在继续造模的同时,开始分别给以环巴胺5mg/kg/d,环巴胺10mg/kg/d腹腔注射,姜黄400mg/kg/d灌胃治疗3周。分别于第3周、第6周收集各组小鼠肝脏、血清标本。比较正常对照组、肝纤维化模型组和各药物干预组之间肝脏生化、羟脯氨酸(Hyp)水平和肝脏病理组织学改变。通过免疫组化、免疫印迹和实时定量PCR法分析各组小鼠肝组织Hh通路的配体Shh,核转录因子Gli1, Gli2,及α平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达情况。 [结果]相比同期肝纤维化模型组,低剂量环巴胺预防组,高剂量环巴胺预防组,姜黄预防组小鼠肝脏生化、肝组织Hyp含量及组织学表现均明显改善。免疫组化显示,预防性给予环巴胺5mg/kg/d,环巴胺10mg/kg/d或姜黄400mg/kg/d均明显减少肝纤维化模型小鼠肝组织中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA阳染细胞的数目。免疫印迹和实时定量PCR显示,预防性给予环巴胺5mg/kg/d,环巴胺10mg/kg/d或姜黄400mg/kg/d均明显减少肝纤维化模型小鼠肝组织中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA mRNA表达,降低Gli1, a-SMA蛋白水平的表达。相比同期肝纤维化模型组,低剂量环巴胺治疗组,高剂量环巴胺治疗组,姜黄治疗组小鼠肝脏生化、肝组织Hyp含量及组织学改变均未见明显改善。免疫组化显示,比造模延迟3周给予环巴胺5mg/kg/d,环巴胺10mg/kg/d或姜黄400mg/kg/d均不能减少肝纤维化模型小鼠肝组织中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA阳染细胞的数目。免疫印迹和实时定量PCR显示,延迟给予环巴胺5mg/kg/d,环巴胺10mg/kg/d或姜黄400mg/kg/d均不能显著减少肝纤维化模型小鼠肝组织中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA mRNA水平的表达,或降低Gli1, a-SMA蛋白水平的表达。 [结论]环巴胺及姜黄可以预防和改善CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化,其作用机制与抑制Hh通路的异常激活有关,可能成为治疗肝纤维化的新药物。延迟给予环巴胺及姜黄均不能显著改善小鼠肝纤维化,因此对于用药时机的选择,仍需要进一步研究。


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