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苦荞麦化学成分及其代谢产物分析和鉴定方法研究

任强  
【摘要】:苦荞麦是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill)一年生草本植物,具有辅助降糖、抗氧化以及抗肿瘤等药理作用。近年来苦荞麦被加工成各种保健食品。目前,关于苦荞麦化学成分、代谢产物分析和鉴定的研究较少。本论文对苦荞麦的化学成分、分析方法及体内代谢产物三个方面进行了研究,为深入认识苦荞麦药效物质基础以及合理进行质量控制和资源开发利用奠定基础。 首先采用色谱分离技术,从苦荞麦70%乙醇提取物中提取分离得到11个主要化学成分,通过紫外光谱(UV)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)技术鉴定化合物的结构。11个主要化学成分包括糖苷类、酰胺类和黄酮类化合物,分别是1,3,6'-tri-p-coumaroyl-6-feruloyl sucrose (1),3,6-di-p-coumaroyl-1,6'-di-feruloyl sucrose (2),1,6,6'-tri-feruloyl-3-p-coumaroyl sucrose (3),1,3,6,6'-tetra-feruloyl sucrose (4), N-trans-feruloyltyramine (5), Quercetin-3-O-β-D-galactoside (6), Quercetin-3-O-β-D-glucoside (7), Kaempferol-3-O-β-D-galactoside (8), Kaempferol-3-O-β-D-glucoside (9), Quercetin-3-O-α-L-rhamnoside (10), Quercetin-3-O-[β-D-xylosyl-(1→2)-α-L-rhamnoside](11),其中1个化合物(4)为新化合物,有4个化合物(2、3、5、11)首次从该属中分离得到。体外活性筛选发现糖苷类化合物(2、3、4)、酰胺类化合物(5)和部分黄酮类化合物(10和11)具有较好的抗氧化活性,糖苷类化合物(2和3)具有较好的肝保护活性。 为了进一步深入分析和鉴定苦荞麦中微量和难以分离得到的化学成分,采用HPLC-PDA/LTQ-FTICRMS技术,建立了苦荞麦70%乙醇提取物中化学成分的分析方法,采用Kinetex C18反相色谱柱(4.6×100mm,2.6μm, Phenomenex),以0.1%冰醋酸水溶液和乙腈为流动相,梯度洗脱,流速0.5mL/min;柱温35℃;进样量2μL;检测波长320nm;分流比1:1,采用ESI离子源正离子检测模式。一级质谱采用全扫描模式获得高分辨质谱数据,通过数据依赖性扫描模式获得多级质谱数据。分析了11个单体化合物的高分辨质谱数据、多级质谱数据和特征紫外吸收光谱等信息,总结了已知化学成分的质谱裂解规律;基于总结的质谱裂解规律和检测到苦荞麦中其他化合物的高分辨质谱数据和多级质谱数据以及紫外光谱等信息,从苦荞麦提取物中共计鉴定了36个化学成分,其中15个化学成分确定其结构,另外21个化学成分通过质谱数据推测了它们可能的结构。 为了能够同时定量分析苦荞麦中极性差别大、结构类似的多种化学成分,采用在线中心切割二维高效液相色谱技术,建立了苦荞麦中12个化学成分定量分析方法。第一维采用Acclaim Mixed-Mode HILIC-10(2.1×10mm,3μm)色谱柱,第二维采用Acclaim RSLC Phenyl-1(2.1×150mm,3μm)和Acclaim RSLC PolarAdvantage Ⅱ (2.1×150mm,2.2μm)两根色谱柱,通过两个切换阀以并联的方式连接;柱温40℃;检测波长320nm;流速0.5mL/min;进样量4μL;以0.03%磷酸水溶液和乙腈为流动相,洗脱方式为梯度洗脱。利用阀切换通过正向和反向冲洗相结合的洗脱方式,将苦荞麦提取物分成两个部分,一部分主要含有黄酮和酰胺类化合物,另一部主要含有糖昔类化合物,两个部分分别在不同固定相的第二维色谱柱中进行分离分析,结果使得极性相差较大、结构类似的12个化合物实现完全分离。方法验证结果显示,所建立的在线中心切割二维高效液相色谱分析方法能够满足苦荞麦中12个化学成分准确测定的要求,重复性(RSD3.4%),日内精密度和日间精密度(RSD4.6%),加样回收率(91.21-107.76%),检出限(0.05-0.21μg/mL)和定量限(0.10-0.41μg/mL)。表明所建立的方法准确、可靠,能够对苦荞麦不同部位以及全草进行定量分析,为评价苦荞麦的质量和资源合理开发,提供可靠的数据支持。在线中心切割二维高效液相色谱分析方法与常规HPLC分析方法相比,显著提高了分离的选择性,能够同时定量分析中草药中的不同结构类型以及同类型结构相似的多个化学成分。 大鼠原位肝肠灌流模型能够有效模拟大鼠体内肝肠代谢情况,具有基质相对简单,原药用量少等优势。因此采用大鼠原位肝肠灌流模型对从苦荞麦中分离得到的有效成分酰胺类、黄酮类和糖苷类三类11个化学成分进行代谢产物研究。建立了HPLC-PDA/LTQ-FTICRMS分析方法,分析灌流液、肠内容物以及胆汁样品中的代谢产物。采用Kinetex C18反相色谱柱(4.6×100mm,2.6μm, Phenomenex)色谱柱;流动相采用0.1%冰醋酸水溶液和乙腈体系,梯度洗脱,进样量2μL;检测波长320nm;柱温35℃,流速0.6mL/min。选用ESI离子源,采用正离子检测模式,一级质谱采用全扫描模式获得高分辨质谱数据,采用数据依赖性扫描模式获得多级质谱数据。通过对灌流液、肠内容物和胆汁样品中检测到代谢产物的高分辨质谱质谱数据、多级质谱数据和紫外吸收光谱等信息进行分析,结果发现酰胺类化合物的7个代谢产物,黄酮类化合物的17个代谢产物,糖苷类化合物的10个代谢产物,共计发现34个代谢产物。糖苷类化合物的代谢转化反应主要包括酯水解的Ⅰ相代谢,酰胺类和黄酮类化合物的代谢反应主要为甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代谢。 基于11个单体化合物在大鼠原位肝肠灌流模型上代谢产物的研究结果,进一步探索了苦荞麦提取物复杂体系在大鼠体内的代谢情况。采用大鼠经口灌胃苦荞麦提取物方式,分别收集给药后0-24h和24-48h的粪便和尿液样品;0-12h、12-24h和24-48h的胆汁样品;以及0.5h、1h、3h和6h的血浆样品。样品前处理后,采用建立的大鼠肝肠灌流模型样品的HPLC-PDA/LTQ-FTICRMS分析方法。在粪便中发现和鉴定了5个原型成分(P2,3,4,5,6)和3个代谢产物;在尿液中发现和鉴定了1个原型成分(P3)和代谢产物6个;在胆汁样品中发现和鉴定了1个原型成分(P1)和代谢产物10个;在血浆样品中发现代谢产物3个。共计分析和鉴定了23个化合物,其中17个代谢产物,6个原型成分。苦荞麦提取物在大鼠体内的代谢转化反应与各个单体化合物在大鼠原位肝肠灌流模型上的代谢反应类似,主要为酯水解的Ⅰ相代谢、葡萄糖醛酸化和硫酸化的Ⅱ相代谢,结合已有的研究结果阐述了苦荞麦化学成分在大鼠体内的代谢特点和代谢途径。


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