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溃疡性结肠炎相关性结肠癌动物模型建立及癌变机制初探

唐晓艳  
【摘要】:研究背景:溃疡性结肠炎是一种原因未明的结直肠炎性病变,随着病程延长,癌变风险增加。但目前由于溃疡性结肠炎癌变临床病例积累需较长的时间,存在一定难度,建立溃疡性结肠炎癌变的动物模型起到了重要作用。目前关于溃疡性结肠炎动物模型较多,近年来,少数研究者发现小鼠饮用葡聚糖硫酸钠和普通饮用水数个循环,可有不典型增生和癌变的发生,但所需实验周期较长并且癌变率低[1,2]。文献报道予以小剂量AOM及1个周期2%葡聚糖硫酸钠(DSS,分子量36,000-50,000)致炎刺激,可于短期内(12周)建立溃疡性结肠炎癌变的动物模型[3]。关于溃疡性结肠炎癌变的机制目前认为Wnt途径中的关键蛋白,β-catenin在溃结相关性结肠癌发病机制中起着关键作用。在散发性结肠癌发病机制中,APC突变通常被认为是一个早期事件[4],而在溃疡性结肠炎相关性结肠癌中早期相对少见,而通常发生在晚期[5]。相反地,P53突变通常被认为是“腺瘤——癌变”途径的晚期事件[4],但在溃疡性结肠炎患者中,P53突变通常在早期发生,而且可以在非不典型增生和未定义不典型增生的粘膜病变中检出[6]。在本研究中,我们摸索通过小剂量AOM腹腔注射联合3个周期的葡聚糖硫酸钠(分子量36,000-50,000,浓度为3%-2%-2%)建立溃疡性结肠炎癌变的动物模型,并初步探索APC,β-catenin和P53在溃疡性结肠炎相关性结肠癌发病机制中的作用,以此为研究人类溃疡性结肠炎癌变的机制提供一定的提示线索。 研究目的:通过摸索建立溃疡性结肠炎癌变的动物模型,借助动物模型,探究溃疡性结肠炎癌变过程中的APC,β-catenin和P53的表达情况和K-ras基因第一外显子第12密码子的突变情况,初步探索人类溃疡性结肠炎癌变的分子机制以及早期诊断的指标。 方法与材料:我们选择4-5周龄雄性C57BL小鼠,随机分为四组:A组为建模组AOM+DSS组(20只),B组为DSS组(12只),C组为AOM组(12只),D组为空白对照组(12只)。于SPF级动物房适应性喂养1周后,A组腹腔注射AOM(10mg/Kg),一周后以3%DSS喂养5天,后休息16天,以上述过程为1个循环,重复两个循环(采用2%DSS),B组及C组分别只给予AOM腹腔注射或DSS喂养,D组不予任何处理。实验过程中每1-2天记录小鼠体重、皮毛、精神状态及排便情况,分别于每个循环末各组均处死4只小鼠,3个周期结束后处死全部小鼠(8只/组)。采用乙醚麻醉断颈,分别取远端、近端结肠组织各一块,若可见肉眼肿块,取肿块标本固定,余下标本冻存,显微镜下观察不同时期组织病理变化,通过免疫组化的方法,采用兔抗人多克隆抗体:抗β-catenin抗体(Abcom),抗APC,抗P53抗体(Santa Cruz),研究APC, β-catenin,P53在各阶段的结肠粘膜中的表达情况。同时采用天根的组织DNA提取试剂盒通过提取冻存组织DNA,进行PCR扩增目的片段,.送至公司测序的方法研究K-ras突变。 结果:1.动物模型建立和分组将小鼠随机分组,小剂量AOM(10mg/Kg)腹腔注射联合3周期DSS(分子量36,000-50,000;第一周期3%,第二三周期为2%)喂养,实验第6天AOM+DSS组及DSS组可出现血便或稀便,体重下降,14天后可基本恢复。第3周期结束,A组(AOM+DSS组)中5/8(62.5%)只小鼠结肠可见肿块产生,多位于远段,其次为中段,前段未见,余下各组均未见肿瘤产生。2.P53和β-catenin采用免疫组化方法检测提示正常结肠粘膜中的表达两者均为阴性;β-catenin在溃疡性结肠炎相关性结肠癌,溃疡性结肠炎组织的表达存在显著性差异(P值0.029);P53仅在第2周期结束不典型增生标本中检测到,肿瘤标本中未检测到P53核表达。3.APC蛋白在溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关结肠癌组织中未见明显差异。4. K-ras突变检测溃疡性结肠炎相关结肠癌及溃疡性结肠炎标本中均未检测到K-ras突变。 结论:1.小剂量致癌剂AOM (10mg/Kg)腹腔注射联合致炎剂葡聚糖硫酸钠DSS(分子量36,000-50,000)反复刺激可诱导C57BL小鼠结肠远段及中段产生肿瘤。2.β-catenin在溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结肠癌组织中表达具有显著差异,提示溃疡性结肠炎发生癌变的机制可能与wnt信号途径有关。3.P53突变可能是溃疡性结肠炎癌变过程中的早期事件,在小鼠动物模型的癌变机制可能与人类存在差异。4. K-ras途径在溃疡性结肠炎癌变过程中可能作用较弱。


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