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猪骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞分化过程中Notch4下调

刘昕超  
【摘要】:目的:检测猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)体外培养自发分化和诱导分化过程中Notch4mRNA、Notch4蛋白的变化趋势,探讨Notch4受体对MSCs体外向心肌细胞分化的影响。 方法:密度梯度离心法分离中华小型猪骨髓单个核细胞,贴壁培养法筛选出MSCs体外培养,原代(PO)培养后按1:2比例每3天传代一次。选取第1,2,3和4代(P1,P2,P3和P4)MSCs,连续镜下观察MSCs的形态变化,同时检测自发分化和5-氮胞苷诱导分化状态下它们Notch4mRNA水平和Notch4蛋白表达量的差异。Real Time RT-PCR定量检测细胞Notch4mRNA表达量,以及心肌结构基因和特异性基因的表达量,包括Cx43和cTnI; Western-blot法检测不同细胞Notch4蛋白的表达水平;免疫细胞化学染色法检测MSCs的表面标志(CD34、CD45、CD90和CD29)及心肌细胞特异性的蛋白表达,包括a-横纹肌肌动蛋白(a-sarcomeric actin, a-actin)、心肌肌钙蛋白-T (cardiactroponin-T, cTn-T)和连接蛋白43(connexin43, Cx43);以透射电镜观察分化细胞超微结构。 结果:5天可见贴壁圆形的MSCs逐渐出现多角状突触,呈长梭形,经过7-10天培养,原代(passage0, PO) MSCs形成均一的细胞克隆,融合70-80%;1:2传代以后第二天细胞即可贴壁生长,细胞为多角长梭形,数量增殖到较多时呈漩涡状生长。免疫细胞化学表型鉴定CD45(-), CD29(+), CD90(+)。猪骨髓来源的MSCs在体外正常培养状态下,随着培养时间的延长(P0-P4),细胞之间的连接增多(Cx43表达量上升),心肌特异性标志物增多(cTnI表达量上升),与此同时Notch4较原代细胞显著下调;5-氮胞苷(10μM)诱导2周后,Notch4的基因表达与对照组相比无明显变化,Notch4阳性细胞与对照组相比显著减少,各代MSCs可以生成更多的细胞连接,但是心肌特异性标志物无显著变化。 结论:猪骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞分化过程中Notch4下调。


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