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七氟醚后处理通过影响心肌细胞自噬减少心肌缺血再灌注损伤的机制研究

张玉林  
【摘要】:目的 通过SD大鼠冠状动脉左前降支结扎-复灌开始吸入七氟醚,在体复制心脏缺血再灌注七氟醚后处理模型,观察七氟醚后处理对心功能和血流动力学的影响;探讨七氟醚后处理对心肌细胞凋亡和心肌梗死面积的影响;观察心肌细胞自噬小体数量和形态,检测自噬标志物表达水平,研究七氟醚后处理对心肌细胞自噬流的影响;进一步检测溶酶体酶活性及线粒体通透转化孔开放情况,研究七氟醚后处理通过调节自噬流对溶酶体功能和线粒体稳态的影响。本课题旨在明确七氟醚后处理通过影响心肌细胞自噬减少心肌缺血再灌注损伤的机制,为揭示七氟醚后处理减少心肌缺血再灌注损伤治疗提供新的分子靶点,为扩展七氟醚的临床应用提供新思路。 方法 1.研究分组:实验动物雄性SD大鼠按照随机对照的原则,依据实验目的分组如下:为研究七氟醚后处理的心肌保护作用,分为假手术组(Sham组),假手术和七氟醚吸入组(Sham+SpostC组),心脏缺血再灌注组(I/R组),七氟醚后处理组(I/R+SpostC组)。为研究自噬流的影响,雄性SD大鼠在术前1小时腹腔注射自噬抑制剂氯喹(chloroquine, CQ),增加氯喹和假手术组(CQ+Sham组),氯喹和缺血再灌注组(CQ+I/R组),氯喹和缺血再灌注和七氟醚后处理组(CQ+I/R+SpostC组)。 2.大鼠在体心脏缺血再灌注七氟醚后处理模型:采用开胸结扎左冠状动脉前降支30min,松开结扎线恢复心肌灌注,在松开结扎线即刻吸入2.4%的七氟醚复制大鼠在体心肌缺血再灌注七氟醚后处理模型。 3.心电图及血流动力学监测:利用大鼠的体表肢导联心电图持续监测心率和心律变化,右侧股动脉置管,持续监测术中右侧股动脉血压。 4.心功能监测:心肌再灌注120min时,通过左侧颈总动脉置管到左心室直接测最大左室内压力变化速率(±dp/dt)。 5.ELISA法检测血清cTnI:心肌再灌注120min时,通过右侧颈内静脉取血1mL,离心后分离血清检测肌钙蛋白I(cTnI)水平。 6.1Evans blue染色:心肌再灌注120min时,将LAD重新结扎后,从右侧颈内静脉注入1mLEvans blue,正常灌注心肌颜色变蓝,缺血危险区心肌仍为灰白色。 7.TTC染色:心肌再灌注120min时,用TTC染色心肌,梗死区域的心肌为白色,存活心肌则染成红色。 8.透射电镜检测自噬小体数量和形态:心肌缺血再灌注30min时,取新鲜组织固定在5%戊二醛,制作用于电镜检测的标本。 9Western blot检测心肌组织自噬相关蛋白、溶酶体酶cathepsinB和凋亡相关蛋白的表达:心肌再灌注30min时,提取缺血危险区组织蛋白,检测心肌组织自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平。 10.氯喹抑制心肌缺血再灌注损伤过程中的自噬流:术前1小时大鼠腹腔注射氯喹10mg/kg,通过电镜观察自噬小体数目和形态证实氯喹能抑制心肌细胞自噬流。 11.Tunel检测心肌细胞凋亡:不同处理组心肌再灌注120min时,取缺血危险区心肌组织,放入4%的福尔马林中固定,用于制作石蜡切片。 12.mPTP开放检测:不同处理组心肌再灌注30min时,取新鲜组织尽快进行冰冻切片,完成染色后在505nm波长下观察绿色荧光。 13.溶酶体酶Cathepsin B活性检测:不同处理组心肌再灌注30min时,取新鲜组织匀浆,利用酶活性检测试剂盒完成酶与底物的反应后,在500nm波长下读取吸光度值。 14.统计学分析:所有数据都以平均值±标准差表示。组间均数比较采用one-way ANOVA和Student-Newman-Keul s方法用于多个样本之间的均数比较,每组不同时间点平均动脉压的比较用Two-way重复测量ANOVA和Bonferroni后检验。P0.05认为差异有统计学意义。 结果 1.大鼠左前降支结扎-复灌后,心肌大体颜色观察,血流动力学和心电变化提示动物模型制备成功。 2I/R+SpostC组大鼠平均动脉压在再灌注后期明显高于I/R组(P0.05);再灌注90分钟后,I/R+SpostC组的心率低于缺血再灌注组的心率(P0.05),但在再灌注120分钟时,七氟醚后处理组的心率与缺血再灌注组的心率无明显差异(P0.05)。 3.再灌注120分钟时,I/R+SpostC组大鼠心肌±dp/dtmax明显高于I/R组(4.316±0.422×103VS.3.863±0.299×103mmHg/s,3.430±0.410×103VS.2.954±0.247×103mmHg/s,P0.05) 4.再灌注120min时,Sham组无心肌梗死,I/R+SpostC组与I/R组相比,心肌梗死区与心肌缺血危险区的百分比显著降低(38.7±1.1%vs.17.1±3.8%,P0.05)。 5.再灌注30分钟时,I/R组与Sham组相比,自噬小体数目明显增加(20.0±3.4vs.1.0±1.7/100μm2, P0.05), I/R+SpostC组自噬小体数目较之I/R组明显减少(11.8±1.8vs.20.0±3.4/100μm2, P0.05) 6.再灌注30分钟时,FR组LC3B-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显高于Sham组,I/R+SpostC组LC3B-Ⅱ口Beclin-1水平低于I/R组(p0.05)。 7.再灌注30分钟时, Sham+SpostC组p62表达水平显著低于Sham组(p0.05),I/R组p62表达水平显著高于Sham组;I/R+SpostC组p62表达水平低于I/R组(p0.05)。 8.再灌注30分钟时,I/R组cathepsinB表达水平和酶活性显著高于Sham组(p0.05); I/R+SpostC组cathepsinB表达水平和酶活性显著高于I/R组(p0.05)。 9.氯喹(CQ)抑制心肌缺血再灌注损伤过程中的自噬流,CQ+Sham组自噬小体数目较之Sham组自噬小体数目明显增加(p0.05), CQ+I/R组较之I/R组自噬小体数目无明显增加,CQ+I/R+SpostC组较之I/R+SpostC组自噬小体数目增多(p0.05),CQ能抑制七氟醚后处理影响自噬的作用。 10. CQ+Sham组与Sham组相比,LC3B-Ⅱ表达水平升高(p0.05),CQ导致自噬小体清除障碍, CQ+I/R组LC3B-Ⅱ水平较之I/R组(p0.05)无明显增加,心肌缺血再灌注损伤后自噬小体清除障碍;CQ+I/R+SpostC组与CQ+I/R组比较,七氟醚能降低LC3B-Ⅱ的累积(p0.05)。 11.I/R较之Sham组Beclin-1水平明显增高(p0.05), I/R+SpostC组较之I/R组Beclin-1水平明显降低(p0.05),CQ+Sham组与Sham组,CQ+I/R组与I/R组,CQ+I/R+SpostC组与I/R+SpostC组分别相比,Beclin-1水平均无明显增加(p0.05)。 12. CQ+Sham组与Sham组相比,p62水平明显升高(p0.05),CQ+I/R组的p62水平较之I/R组p62水平无明显变化(p0.05),CQ+I/R+SpostC组较之I/R+SpostC组p62水平显著增加(p0.05),CQ+I/R+SpostC组与CQ+I/R组比较,CQ+I/R+SpostC组能降低p62的累积(p0.05)。 13.I/R组的cathepsinB水平高于Sham组(p0.05); I/R+SpostC组的cathepsin B水平高于I/R组(p0.05)。CQ+Sham组的cathepsin B水平低于Sham组(p0.05);CQ+I/R组较之I/R组,CQ+I/R+SpostC较之I/R+SpostC的cathepsin B水平无明显变化(p0.05)。 14. Sham组(11.95±3.11ng/L), CQ+Sham组(15.15±2.59),I/R组(28.73±4.12),CQ+I/R组(28.03±2.79), I/R+SpostC (19.34±2.64ng/L), CQ+I/R+SpostC组(23.42±2.26ng/L),Sham组与CQ+Sham组cTnI水平无显著差异;,I/R组与CQ+I/R组cTnI水平无显著差异;CQ+I/R+SpostC组较之I/R+SpostC组cTnI水平明显增加,(P0.05)。 15. Evans blue染色用于评估每组大鼠心肌缺血危险区(AAR)的面积与左心室面积的百分比,结果显示:Sham组,CQ+Sham组,I/R组,CQ+I/R组,I/R+SpostC, CQ+I/R+SpostC组心肌缺血危险区(AAR)的面积与左心室面积的百分比分别是:52.9±8.0%,56.2±4.9%,54.5±3.0%,54.9±3.8%,53.6±5.4%,54.0±9.4%各组之间无显著差别(P0.05) 16.TTC染色计算心肌再灌注120min时心肌梗死区与心肌缺血危险区的百分比,用或不用氯喹的条件下,比较各组心肌梗死面积所占缺血危险区面积百分比,结果如下:Sham组与CQ+Sham组无心肌梗死,两组之间心肌梗死面积无显著差别;I/R组(44.2±3.1%)较CQ+I/R组(45.3±4.0%)心肌梗死面积也无明显差别,I/R+SpostC (21.1±4.7%)较之CQ+I/R+SpostC (39.5±4.0%)心肌梗死面积显著减少(P0.05) 17.Sham组线粒体的荧光强度显示的是正常组织的线粒体通透转换孔的开放水平。I/R组线粒体荧光明显减弱,表明线粒体通透转换孔开放增多,由线粒体释放到细胞浆的荧光染料,即刻发生荧光淬灭,荧光强度明显减弱;I/R+SpostC组线粒体荧光强度较之I/R组明显增强,表明线粒体通透转换孔开放减少,由线粒体释放到细胞浆的荧光染料减少,线粒体的荧光强度较之缺血再灌注组明显增强(P0.05),氯喹增加mPTP开放。 18.Sham组,CQ+Sham组,I/R组,CQ+I/R组,I/R+SpostC, CQ+I/R+SpostC组心肌缺血危险区(AAR)凋亡细胞核占正常细胞核的百分比分别是:0%,4.7±2.1%,25.8±3.8%,28.0±2.7%,13.6±4.1%,23.4±3.0%;I/R+SpostC组缺血危险区Tunel阳性的心肌细胞较之I/R组显著减少(P0.05); CQ+Sham组的Tunel阳性细胞核较之Sham组增多(P0.05);I/R组缺血危险区Tunel阳性细胞核较之CQ+I/R组无明显增多(P0.05);I/R+SpostC组缺血危险区Tunel阳性细胞核较之CQ+I/R+SpostC显著减少(P0.05) 结论 1.七氟醚后处理能减少缺血再灌注损伤后心肌梗死面积; 2.七氟醚后处理能减少缺血再灌注损伤后心肌细胞自噬小体堆积,加速自噬流;3.七氟醚后处理能上调溶酶体酶Cathepsin B活性,通过增加自噬小体与溶酶体融合清除自噬小体; 4.七氟醚后处理通过减少心肌细胞自噬小体堆积,抑制缺血再灌注损伤后缺血危险区心肌细胞凋亡;心肌细胞自噬流加速所导致的线粒体mPTP开放减少,可能是七氟醚后处理减少缺血再灌注后心肌细胞凋亡的机制之一 综上所述,本研究结果表明,七氟醚后处理能影响心脏缺血再灌注后心肌细胞自噬流,减少自噬小体堆积。七氟醚后处理通过促进溶酶体功能减少自噬小体堆积,维持线粒体稳态,减少缺血再灌注后心肌细胞损伤,进而抑制交界区心肌细胞凋亡。本研究还证实采用氯喹抑制自噬小体清除,能抵消七氟醚后处理对缺血再灌注心肌的保护作用,进一步证实七氟醚后处理的心肌保护作用依赖于对细胞自噬的调控提供新的实验依据。上述实验结果表明七氟醚后处理调控的细胞自噬可能成为缺血再灌注心肌损伤过程中新的治疗靶点,为临床上通过吸入麻醉药减少缺血再灌注心肌损伤提供了新的视角。


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