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葡萄糖调节蛋白78及其单核苷酸多态性对胰腺癌进展和预后的影响及机制研究

牛哲禹  
【摘要】:研究背景及目的胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一,发病隐匿、进展迅速、手术切除率低、放化疗效果不佳,预后极差,总体5年生存率大约为6%,在全球癌症发病率占第13位,死亡率占第7位。筛选合适的预后标志物,对于临床医师选择恰当的治疗方案,避免不必要的治疗带来的毒副作用,具有重要的意义。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78, GRP78),又称免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein, BIP),是热休克蛋白70家族的一员,位于正常细胞内质网内,是调节内质网应激、参与未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)的重要分子。GRP78在内质网中具有促进蛋白质的正确折叠,维持内质网稳态的作用,在细胞处于缺氧、低糖、低钙等应激状态时,提高细胞的生存能力,并参与多种病理生理过程,如神经系统病变、炎症、肿瘤等。GRP78在肿瘤细胞中的作用已引起了众多研究团队的注意。多个研究显示:GRP78在卵巢癌、弥漫大B淋巴瘤、肾细胞癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌细胞中的表达与癌症细胞的增殖、转移、患者的预后等恶性行为密切相关,并表现出了组织特异性的特点。GRP78在胰腺癌中的表达与胰腺癌患者临床病理学特点和预后的关系尚未见报道。本研究拟通过临床观察及体外细胞实验检测GRP78的表达及其在胰腺癌发生、进展中表达变化及与胰腺癌病人临床病理特征及预后的关系,并探索GRP78基因的单核苷酸多态性与胰腺癌病人预后的相关性。研究内容1.研究胰腺癌组织中GRP78的表达情况及与胰腺癌病人临床特征及预后的关系。2.研究不同胰腺癌细胞株细胞中GRP78的表达及对胰腺癌细胞株细胞增殖、侵袭及迁移的影响及相关机制。3.检测GRP78在小鼠胰腺癌发生及演进过程中的表达。4.探索GRP78单核苷酸多态性与胰腺癌手术病人总生存期的关系。方法:1.应用免疫组织化学技术(1mmunohistochemistry, IHC)检测手术切除经病理诊断为胰腺癌的组织标本中GRP78的表达情况,分析GRP78与胰腺癌临床病理特点及胰腺癌患者预后的关系。2. Western blot技术检测各胰腺癌细胞株细胞中GRP78的基础表达情况。应用siRNA转染技术敲低高表达细胞株中的GRP78表达,利用质粒转染对低表达细胞株进行过表达,并设置相应的对照组。CCK8法检测GRP78对胰腺癌细胞增殖的影响,利用流式细胞术检测细胞周期及凋亡,western blot检测GRP78促进胰腺癌细胞增殖的具体作用形式;利用transwell法检测GRP78对胰腺癌细胞侵袭及转移的关系,western blot检测可能的作用机制;3.应用二甲基苯并蒽(9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene, DMBA)原位埋入C57BL/6小鼠的胰腺实质建立癌前病变和胰腺癌发生进程的模型,利用免疫组化染色技术分别检测GRP78在正常胰腺导管上皮、胰腺上皮内瘤变(Pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)和胰腺癌中的表达,探讨GRP78与胰腺癌发生及演变的关系。4.收集10家合作单位的胰腺癌手术病例,质谱法检测胰腺癌病人外周血单核细胞DNA中的rs430397位点突变;利用病例对照研究调查汉族人群中单核苷酸位点rs430397突变与胰腺癌预后的关系。结果:1.与癌旁正常导管细胞相比,GRP78在人胰腺癌癌组织的细胞浆中呈高表达,并与胰腺癌的T分期显著相关;GRP78高表达是影响胰腺癌术后生存期的独立危险因素,GRP78高表达与胰腺癌患者预后不良相关。2.敲低GRP78表达显著降低胰腺癌细胞株SU86.86与BxPC-3的增殖、侵袭及迁移能力并增加了由吉西他滨诱导的细胞凋亡程度。相反,过表达GRP78后,Capan-1的增殖及侵袭迁移能力显著增强,并增加了胰腺癌对吉西他滨的耐药性。Westernblot显示GRP78通过影响细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4/CDK6的表达影响肿瘤的增殖,通过影响cleaved caspse-3和cleaved RARP的表达影响吉西他滨诱导的细胞凋亡。通过一系列上皮间质转换相关蛋白RhoA,ROCKl,JAK2,vimentin,Smad4,p-STAT3影响了肿瘤的侵袭迁移能力。3.小鼠模型胰腺癌组织中GRP78表达显著高于癌旁正常导管细胞(P0.01)。胰腺癌及高级别PanIN(hi曲grade PanIN,H-PanIN)中的GRP78表达明显高于低级别PanIN(10w grade PanIn,L-PanIN)和慢性胰腺炎组织中的表达(P0.01)。4.GRP78基因rs430397突变可分为AA、AG及GG型,其中基因型为AA及AG的患者术后总生存期显著短于基因型为GG的患者。结论:GRP78在胰腺癌中高表达,可促进胰腺癌细胞增殖、侵袭迁移及化疗耐药,有可能成为胰腺癌治疗的新靶点。GRP78及其单核苷酸多态性位点rs430397与胰腺癌病理分级及预后密切相关,有可能成为胰腺癌的预后指标。


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