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Notch信号通路在骨髓来源的间充质干细胞诱导调节性DC生成中的作用及分子机制的研究

任少达  
【摘要】:研究背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),目前已经在骨髓、脐带、脂肪等多种组织器官中分离得到。MSCs除具备干细胞的基本特性外,还具有低免疫原性、免疫调节能力等特性,因而引起了再生医学领域的广泛关注。MSCs发挥免疫调节能力的可能机制主要是通过分泌具有抑炎作用的可溶性因子或通过细胞-细胞间的直接接触来发挥免疫调节作用。树突状细胞(dendritic cell, DC)由造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)发育分化而来,在先天性免疫和获得性免疫中均有重要作用,而最近发现的调节性DC具有较强的免疫调节能力,在免疫系统中作用显著。因此我们研究MSCs诱导HSCs生成具有调节作用的DC,不仅具有重要的理论意义,还为MSCs用于临床细胞治疗提供了理论依据。本课题前期研究发现小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)来源的MSCs在无外源添加因子的情况下可通过分泌可溶性因子影响调节性DC的生成。那么,骨髓来源的MSC在无外源添加因子时是否也可以诱导生成调节性DC还有待进一步的研究。我们发现,小鼠骨髓来源的MSCs (bone marrow MSCs, BM-MSCs)高表达Notch配体,那么Notch信号通路能否影响共培养体系中调节性DC的生成值得进一步深入研究。本论文致力于研究Notch通路在调节性DC生成过程中的作用及其详细的分子机制。研究目的 基于上述研究现状和提示,我们系统地研究了BM-MSCs诱导HSCs生成调节性DC的详细分子机制。1.研究BM-MSCs诱导生成调节性DC的免疫表型、转录因子表达情况和因子分泌情况。2.研究这种调节性DC在体内外的免疫调节功能及对结肠炎模型(Inflammatory bowel disease, IBD)的治疗作用。3.研究Notch通路在BM-MSCs诱导生成调节性DC过程中的作用及其详细分子机制。研究方法1.利用磁珠分选纯化获得BM-MSCs,运用ELISA、qRT-PCR和流式细胞术研究其生物学特性。2.在体外BM-MSCs与HSCs共培养诱导生成一种DC,命名为sBM-DCs,经流式细胞术检测sBM-DCs的表型,Western blot和qRTPCR分别在蛋白和mRNA水平上检测转录因子表达情况,ELISA检测细胞因子分泌情况。3.利用混合淋巴细胞反应和迟发型超敏反应(Delayed hypersensitivity, DTH)实验验证其在体内外的免疫调节能力,并用流式细胞术研究对T细胞活化标志的影响。4.通过HE染色、ELISA研究sBM-DCs对IBD模型的治疗作用,并用流式细胞术研究sBM-DCs发挥作用的机制。5.在共培养体系中加入Notch通路抑制剂DAPT,通过流式细胞术、Western blot、ELISA研究细胞生物学特性的变化,并通过混合淋巴细胞反应实验研究其免疫调节能力的变化。6.采用siRNA干扰技术敲低BM-MSCs的Notch配体后,之后再与HSCs共培养,研究生成细胞与sBM-DCs的差异。7.利用病毒感染、Chip和Co-IP实验研究Notch通路起作用的详细机制。8.利用Chip实验研究表观遗传调控在sBM-DCs生成过程的影响。研究结果我们首先发现,在无外源细胞因子的情况下,BM-MSCs与HSCs共培养诱导生成一种新型调节性sBM-DCs:该细胞高表达CDllb,低表达CDllc、 CD40. CD80、CD86、Ia; PU.1、Ikaros、RBP-J中度表达,IRF4、IRF8、Batf3、 SpiB、TCF4低表达,Relb、TRAF6、c-Maf、MafB不表达;同时还发现具有较强的吞噬能力,可分泌较高水平的IL-10。sBM-DCs在体内外具有较强的免疫调节能力:在体外,sBM-DCs可以抑制同种淋巴细胞增殖,抑制T细胞活化标志CD44和CD69的表达;在体内,sBM-DCs可以明显减轻DTH反应,还对IBD小鼠的肠炎具有一定的治疗作用。进一步研究结果表明,此治疗作用可能与增加抑炎因子IL-10的分泌、降低炎症因子IL-2和TNF-a的分泌及增加CD4+CD8+调节性T细胞的比例有关。Notch通路在sBM-DCs生成过程中发挥着重要作用,加入Notch通路抑制剂DAPT和干扰BM-MSCs的Notch配体Jagged1阻断Notch通路后,所生成细胞变化结果类似:CDllb显著降低,CD40、CD80、CD86和Ia有不同程度地升高;Ikaros和RBP-J表达水平降低,IRF8、TCF4和TRAF6呈不同程度地升高;分泌的IL-10降低、IL-12升高;免疫调节能力基本丧失。进一步研究结果表明,Notch通路通过RBP-J和表观遗传调控抑制IRF8的表达进而抑制炎症因子的分泌对sBM-DCs生成必不可少:干扰IRF8的表达后,IL-12的mRNA和蛋白水平表达均降低,IRF8可通过与IL-12的启动子直接结合来调控IL-12的表达;干扰RBP-J的表达后,IRF8的mRNA和蛋白水平表达均下调,表明IRF8和RBP-J的表达存在密切关联,再加入DAPT并不能升高IRF8的表达,进一步说明Notch通路通过RBP-J控制IRF8的表达;在sBM-DCs生成过程中,RBP-J处于去乙酰化状态抑制IRF8的表达,加入DAPT后,RBP-J处于乙酰化状态,上调IRF8的表达;Notch通路还可以改变IRF8基因的组蛋白修饰状态,控制其表达水平。结论1.在无外源添加因子的情况下,BM-MSCs诱导HSCs生成一种新型sBM-DCs,具有较低免疫原性、较强的吞噬能力;表达PU.1、Ikaros、RBP-J,低表达IRF4、IRF8、Batf3、SpiB、TCF4,不表达Relb、TRAF6、c-Maf、MafB;还可以分泌较高IL-10。2. sBM-DCs在体内外具有免疫调节能力。3. Notch通路在sBM-DCs生成过程中起着重要作用,可通过RBP-J和表观遗传调控抑制IRF8的表达来抑制而抑制sBM-DC分泌炎症因子


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