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耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子特征、耐药机制及药物发现

吕月蒙  
【摘要】:抗生素滥用和不合理使用导致的细菌耐药性已成为世界抗感染治疗领域面临的严峻问题之一。2014年,世界卫生组织(World Health Organization)首次在全球范围内收集病原菌耐药(antibacterial resistance, ABR)情况数据,发布全球性耐药监测报告及指导原则,其中革兰氏阴性肠杆菌科细菌耐药问题尤为严重。中国作为抗生素使用大国,细菌耐药情况更是不容乐观。有报道称我国住院患者使用广谱抗生素或联合使用两种以上抗生素比例约为58%,大大超过国际标准。世界卫生组织2012年在中国收集的约5.5万株临床肺炎克雷伯杆菌中,耐碳青霉烯类抗生素耐药菌比例为7.1%,对第三代头孢菌素类药物头孢噻肟耐药率则高达52.5%[3]。中国CHINET细菌耐药监测报告也显示,肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素虽高度敏感,但总耐药率呈逐年上升趋势,从2006年1%上升到2013年≤7%。革兰氏阴性耐药菌包括产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌(大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等)和非发酵糖细菌(non-fermenters)(鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等)。其中,肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌耐药情况最为严重,伴随着越来越多临床多重耐药和泛耐药菌株的出现,实验室诊断和临床抗感染治疗日益困难。导致肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南或者美罗培南的一类β-内酰胺酶,按照Amber分类分为三类:A类,B类和D类。其中,B类碳青霉烯酶为金属p-内酰胺酶(Metallo-beta-lactamase, MBL),包括NDM-1、VIM2、IMP等。此类酶可水解头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素,但对单环p-内酰胺类抗生素(氨曲南)和EDTA等螯合剂敏感,主要存在于铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌。产金属p-内酰胺酶NDM-1的超级肺炎克雷伯杆菌于2009年首次在印度新德里被发现[4],除了可以水解几乎所有临床常用药,blaNDM-1常与其他耐药基因,比如ESBLs,共存共转移扩大耐药菌底物谱而引起广泛关注。其中blaCTX-M-15在共转移ESBLs耐药基因中最为常见,同时blaCTX-M-15也是九十多种CTX-M亚型中世界范围内检出率最高的一种。其次,blaTEM-1, blaOXA-1, blaOXA-10也常常被同时检出[5]。CTX-M-15可高度水解头孢噻肟,适度水解氨曲南,填补了NDM-1不能水解氨曲南的空白,两者共存,扩大了携带NDM-1耐药菌的耐药范围,增加了感染NDM-1病人的用药困难。不仅如此,与NDM-1耐药酶基因相关的可移动遗传元件,如转座子,整合子,毒力因子,可转移质粒等,以及其他种类耐药酶基因的存在,使得携带NDM-1的耐药菌不仅对三代头孢菌素类药物耐药,对其他大多数抗生素如喹诺酮类,氨基糖苷类药物也耐药,并且呈现传播越来越广泛的特点。目前已经在肺炎克雷伯菌,大肠埃希菌以及枸橼酸杆菌中发现同时携带blaNDM-1和blaCTX-M-15的可转移质粒。最近几年,在国内也有关于NDM-1在不动杆菌属,屎肠球菌,肺炎克雷伯菌以及大肠埃希菌中被发现的报道。由此可见,携带NDM-1以及同时携带NDM-1和CTX-M-15的革兰氏阴性耐药菌所造成的感染将成为革兰氏阴性菌感染中最棘手的问题之一,并且大有传播日益广泛的威胁。抗生素的滥用和不合理使用问题可依靠制定抗生素使用规范,加强抗菌药物使用管理予以控制,而细菌耐药性问题则需从多方面入手解决,一方面加强对细菌的耐药性监测,指导临床合理用药(对指导临床合理选药,提高疗效,控制多药耐药菌的流行有重要意义);一方面,从基因水平对耐药菌传播机制进行研究,研发细菌耐药抑制剂(如水解酶抑制剂、外排泵抑制剂等);另一方面寻求新型抗菌药物,如非抗生素的天然抗菌肽、人工合成杂合抗菌肽及抗菌抗体等。基于以上背景,以及本实验室保存有大量ATCC标准菌株和本地区医院分离革兰氏阴性菌等优势,本课题从三部分展开研究:第一部分,对北京地区2002-2004年及2010-2014年收集的625株临床肠杆菌科细菌进行CRE耐药率测定,结果显示2002-2004年CRE耐药率为0.8%,2010-2014年耐药率增长至4.9%。同时对实验室保存的7株同时携带blaNDM-1和blaCTX-M-15的特征肠杆菌科菌株进行整合子、不相容质粒群、流行性质粒及菌株分型、脉冲场凝胶电泳、耐药机制分析等分子特征研究,为耐药菌流行趋势作出前瞻性研究,也为更进一步揭示革兰氏阴性耐药菌耐药机制提供了理论基础。第二部分,原核细胞重组表达标准菌株及临床菌株中的碳青霉烯酶,建立重组碳青霉烯酶库,用于筛选新型酶稳定化合物或酶抑制剂,以及建立碳青霉烯酶质谱库,用于CRE菌株感染的早期诊断。表达的碳青霉烯酶分别为实验室保存标准菌株K. pneumoniae ATCC(?)BAA2146, K. pneumoniae ATCC(?)700603, K. pneumoniaeATCC(?)BAA1898和K. pneumoniae ATCC(?)BAA1905中的碳青霉烯酶CTX-M-15, SHV-18, KPC1/2, KPC3以及临床菌株P. aeruginosa 08-14和4.baumannii 09-1中的碳青霉烯酶VIM2和OXA23。其中对CTX-M-15和VIM2进行了重组酶水解活性测定和酶抑制剂水解保护特性研究,以及酶促动力学参数测定。第三部分,重组表达天然杀菌素Colicin la,人工合成杀菌通透性增加蛋白(Batericidal permeability increasing protein, BPI)的活性十肽KWKAQKRFLK,并依靠基因工程方法将两者连接,重组表达杂合抗菌肽Colicin Ia+KWKAQKRFLK,测定三种抗菌肽对常见ATCC标准菌株的最小抑菌浓度,结果显示:Colicin la, KWKAQKRFLK及杂合抗菌肽对ATCC(?)25922的杀菌活性最强,MIC值为64μg/ml。


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