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从调控线粒体自噬探讨小续命汤有效成分组对缺血性脑卒中的作用机制

杜肖  
【摘要】:脑卒中又称脑中风或脑血管意外,是由于脑部供血障碍或脑血管破裂引起的一种急性脑血管疾病,分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种,死亡率和致残率极高,严重威胁着人类的生命健康。然而,由于缺血性脑卒中病理进程复杂,迄今为止正式被批准使用的有效治疗药物还为数不多。中药复方小续命汤是治疗缺血性脑卒中的经典方剂,小续命汤有效成分组是依据小续命汤适应症脑缺血的发病机制,通过体外筛选模型优化确定的小续命汤抗脑缺血的有效药理活性组分。我们前期研究证实小续命汤有效成分组能够作用于缺血区神经细胞线粒体,显著改善缺血后神经元线粒体能量代谢障碍,提高线粒体膜电位,抑制线粒体凋亡途径。近年来的研究发现,脑缺血再灌注损伤与线粒体自噬功能紊乱有着密切的联系,缺血性损伤导致线粒体功能受损,而线粒体自噬清除受损线粒体,完成损伤线粒体的降解,维持自身稳态平衡,实现线粒体质量控制,因此靶向调节线粒体自噬或能降低脑缺血再灌注损伤。基于此,本课题以线粒体自噬为切入点,提出线粒体网络的稳态失衡在缺血性脑卒中发生发展过程中具有重要意义,小续命汤有效成分组可通过调节线粒体自噬,调控线粒体稳态失衡改善神经元功能来治疗缺血性脑卒中。因此,本研究采用局灶性脑缺血再灌注大鼠为观察对象,以小续命汤有效成分组为干预手段,探讨小续命汤有效成分组对模型大鼠脑缺血改善情况,观察其对线粒体功能及线粒体自噬变化的影响,从调节线粒体自噬的角度揭示小续命汤有效成分组对缺血性脑卒中的作用机制。第一部分小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑线粒体功能损伤的影响目的考察小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑线粒体功能损伤的影响。方法选用健康雄性SD大鼠,体重250 g-280 g,随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、小续命汤有效成分组(XXMD)低、中、高剂量组和金纳多(EGb 761)组,插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后实现再灌注,假手术组大鼠不进行线栓插入操作。待大鼠清醒后给予药物,小续命汤有效成分组和金纳多均采用灌胃给药,每日一次,连续四天。测定给药4天时MCAO大鼠缺血周边区大脑皮层组织线粒体膜肿胀度、ATP酶活性(Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase)以及线粒体超氧阴离子(O2)和钙离子含量,研究小续命汤有效成分组对脑缺血再灌注大鼠脑线粒体功能的影响。结果与模型组相比,给药4天时小续命汤有效成分组能够显著改善MCAO大鼠的脑线粒体功能损伤,表现为显著改善脑缺血再灌注大鼠脑线粒体Na+-K+-ATPase(P0.05,P0.01)和 Ca2+-Mg2+-ATPase 活力(P0.05,P0.01),降低线粒体钙离子含量(P0.01)和超氧阴离子含量(P0.05)。结论小续命汤有效成分组能够减轻脑缺血再灌注导致的线粒体氧化应激反应和钙超载,改善线粒体功能。第二部分小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑线粒体自噬的影响及作用机制研究目的考察小续命汤有效成分组对局灶性脑缺血再灌注大鼠皮层神经元不同时间点线粒体自噬的影响及相关机制。方法选用健康雄性SD大鼠,体重250 g-280 g,随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、小续命汤有效成分组(XXMD)中剂量组和自噬激活剂雷帕霉素(RAP)组,插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后实现再灌注,假手术组大鼠不进行线栓插入操作。待大鼠清醒后给予药物,小续命汤有效成分组采用灌胃给药,雷帕霉素采用腹腔注射给药,每日一次,连续四天。采用Zea-Longa's级标准评分法和神经功能缺损评分(mNSS)实验来测评小续命汤有效成分组和雷帕霉素给药对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学的影响,TTC染色法检测大鼠脑梗死体积百分比和半球肿胀。Western blot法检测给药后24h、48h、72h和96h时自噬及线粒体自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表达水平变化,透射电镜观察再灌注24h时缺血半暗带皮层神经元细胞中线粒体形态及线粒体自噬超微结构。结果与模型组相比,给药4天时小续命汤有效成分组和雷帕霉素能够显著改善MCAO大鼠神经功能缺损,表现为降低MCAO大鼠mNSS评分(P0.05,P0.01),延长MCAO大鼠在平衡木上的停留时间(P0.05,P0.01)。TTC结果显示,小续命汤有效成分组和雷帕霉素能够显著减少给药4天时MCAO大鼠脑组织梗死体积百分比(P0.05,P0.01),并可显著缩小其半球肿胀(P0.01)。Western blot检测结果显示,脑缺血再灌注24 h时,缺血周边区脑组织中自噬及线粒体自噬均被显著激活,表现为细胞总蛋白和纯化线粒体蛋白中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化显著增多(P0.05,P0.01),细胞总蛋白中P62、Beclin-1及BNIP3的表达水平发生下降(P0.05),而纯化线粒体蛋白中P62及BNIP3的表达水平则显著上升(P0.05,P0.01)。缺血再灌注48 h时线粒体自噬被抑制,且随着再灌注时间的延长,线粒体自噬出现持续下降现象。与模型组相比,小续命汤有效成分组给药24 h时,能够通过降低 P62、Beclin-1、BNIP3 的表达水平以及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 的比值(P0.05,P0.01)抑制脑缺血再灌注后24 h时线粒体自噬的过度激活。其对线粒体自噬的抑制作用延续至再灌注48 h,随着时间进一步延长,小续命汤有效成分组对线粒体自噬的抑制作用消失。缺血再灌注时间延长至96 h时,小续命汤有效成分组对P62、Beclin-1及BNIP3的表达出现明显激活作用(P0.05,P0.01),并能增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P0.05),从而激活线粒体自噬,促进受损线粒体的自噬性清除。电镜检测结果显示,脑缺血再灌注24 h时,模型组大鼠脑组织神经元细胞中有大量空泡结构的自噬泡及大量线粒体自噬结构。与模型组相比,XXMD给药组大鼠脑神经元核膜较为完整,细胞器较模型组明显增多,自噬泡及线粒体自噬结构明显减少。结论脑缺血再灌注后线粒体自噬随病程进展呈现先激活后抑制现象,过高和过低的线粒体自噬均不利于神经细胞的存活。小续命汤有效成分组能够调节缺血后不同时间点自噬及线粒体自噬相关蛋白的表达水平,抑制缺血再灌注后24h时线粒体自噬的过度激活,促进缺血再灌注后期线粒体自噬。第三部分应用线粒体自噬抑制剂后观察小续命汤有效成分组对脑缺血再灌注损伤的影响目的考察应用线粒体自噬抑制剂mdivi-1后对小续命汤有效成分组脑缺血再灌注损伤保护作用的影响及机制。方法选用健康雄性SD大鼠,体重250 g-280g,随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、小续命汤有效成分组(XXMD)中剂量组、小续命汤有效成分组联合线粒体自噬抑制剂mdivi-1作用(XXMD+MDI)组及线粒体自噬抑制剂mdivi-1组,插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后实现再灌注,假手术组大鼠不进行线栓插入操作。待大鼠清醒后给予药物,小续命汤有效成分组采用灌胃给药,mdivi-1采用腹腔注射给药,每日一次,连续四天。采用Zea-Longa's级标准评分法和神经功能缺损评分(mNSS)实验来观察小续命汤有效成分组以及小续命汤有效成分组联合mdivi-1给药对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学的影响,TTC染色法检测大鼠脑梗死体积百分比和半球肿胀,Western blot法检测给药4天时,MCAO大鼠脑线粒体中自噬及线粒体自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表达水平。结果与XXMD组相比,应用线粒体自噬抑制剂mdivi-1后,小续命汤有效成分组对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用显著减弱,表现为MCAO大鼠mNSS评分升高(P0.05),在平衡木上的停留时间减少(P0.05),脑组织梗死体积百分比增多(P0.01),并可增加其半球肿胀(P0.05)。Western blot检测结果显示,应用线粒体自噬抑制剂mdivi-1后,小续命汤有效成分组大鼠脑线粒体P62和Beclin-1的表达降低(P0.05,P0.01),LC3-I向LC3-II的转化减少(P0.05),说明线粒体自噬减弱。结论线粒体自噬抑制剂mdivi-1能够抑制线粒体自噬,并能进一步加重脑缺血再灌注损伤。应用线粒体自噬抑制剂mdivi-1后,小续命汤有效成分组对MCAO大鼠的神经功能保护作用显著降低,说明小续命汤有效成分组可能通过调节线粒体自噬发挥神经保护作用。


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