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胰腺癌中透明质酸的生物学效应研究及衔接蛋白的临床病理意义

陆俊良  
【摘要】:背景及目的近年来,胰腺癌的发病率呈上升的趋势,但传统治疗及现有的靶向治疗并未取得很明显的进展,而胰腺间质中的星形细胞则成为了寻找新的治疗靶点的一个新热点。透明质酸是一种直链的多糖大分子。在哺乳类动物中,透明质酸合成酶2(Hyaluronan Synthase 2,HAS2)是合成透明质酸最主要酶,而透明质酸最主要的降解酶则是透明质酸酶1(Hyaluronidase 1,HYAL1)。已有研究表明,透明质酸在胰腺癌中发挥促肿瘤生长及促迁移的作用,但是其来源及作用机制尚不明晰。本研究分两部分进行:第一部分,我们探究了胰腺星形细胞在透明质酸生成中的角色,然后利用外源性透明质酸处理胰腺癌细胞系以验证其生物学效应,并探索透明质酸处理后胰腺癌细胞中主要的透明质酸受体分化簇抗原44(Cluster of Differentiation,CD44)和透明质酸介导的细胞游走受体(Receptor of Hyaluronan Mediated Motility,RHAMM)的表达情况,初步探讨了透明质酸的作用机制。最后我们检测了调节透明质酸代谢的主要酶在胰腺癌临床样本中的表达,研究其临床病理联系。第二部分,我们研究了透明质酸最主要的受体CD44及其下游信号通路之间的可能的衔接蛋白GRB2相关性结合蛋白(GRB2-associated binding protein,GAB2),成纤维细胞生长因子受体底物2(Fibroblast growth factor receptor substrate 2,FRS2)和 CRK样原癌基因编码的蛋白(CRK Like Proto-Oncogene,CRKL)在胰腺癌病例中的表达、临床病理联系及预后价值,为进一步阐明透明质酸在胰腺癌中的作用机制奠定基础。材料与方法第一部分:我们应用Real-Time PCR及Western Blot方法检测了胰腺癌细胞系及原代胰腺星形细胞中调节透明质酸代谢的主要酶HAS2和HYAL1的表达,并应用Elisa和琼脂糖凝胶电泳对胰腺癌细胞系,胰腺星形细胞上清中的透明质酸进行了定量和定性分析,同时验证了胰腺癌组织中透明质酸的含量。随后我们通过外源性透明质酸处理或应用shRNA敲降胰腺癌细胞中的HYAL1表达,观察对胰腺癌细胞生物学行为的影响,然后通过Western Blot检测透明质酸处理对胰腺癌细胞中CD44和RHAMM表达的影响,分析可能的作用机制。最后在收集的胰腺癌临床样本中应用免疫组化检测HAS2和HYAL1的表达,分析其临床病理联系。第二部分,我们从北京协和医院病理样本库中调取了满足以下要求的胰腺导管腺癌的样本:1)登记日期为2011年1月至2016年1月)接受胰腺癌根治手术3)未接受术前放化疗,对切片进行病理复核,并进行电话随访以获得患者临床病理资料及预后信息。应用免疫组化检测其中GBA2,CRKL及FRS2的表达,研究其与胰腺癌患者临床病理特点的联系及预后价值。结果:第一部分:活化的胰腺星形细胞中HAS2的表达高于静止的胰腺星形细胞;胰腺星形细胞中HAS2和HYAL1的表达均低于胰腺癌细胞。胰腺癌组织中的透明质酸主要以高分子量透明质酸形式存在;胰腺星形细胞上清中的透明质酸为高分子量透明质酸,其含量显著高于胰腺癌细胞。使用高分子量透明质酸处理胰腺癌细胞可促进其迁移,抑制其增殖。敲降HYAL1后可降低高分子量透明质酸促胰腺癌细胞迁移的能力,并减少透明质酸入胞。高分子量透明质酸处理后胰腺癌细胞中CD44发生断裂。在18例临床样本中,HAS2的表达率为85.17%,而HYAL1则在所有病例的肿瘤细胞中表达;HAS2的表达与肿瘤大小及神经侵袭相关。第二部分:GAB2、CRKL、FRS2的阳性率分别为40%,53.95%和 35.06%。GAB2、CRKL、FRS2及三者共表达都为无病生存期及总生存期的不良预后因素,其中GAB2阳性为无病生存期的独立不良预后因素,而GAB2/CRKL/FRS2共表达为总生存期的独立不良预后因素。结论:活化的胰腺星形细胞中高表达的HAS2是胰腺癌间质中高分子量透明质酸的来源之一。高分子量透明质酸可促进胰腺癌细胞的迁移,该作用可能与HYAL1表达及CD44断裂相关。此外,CD44潜在的下游分子衔接蛋白GAB2、CRKL及FRS2在胰腺癌中普遍表达,具有显著的预后价值。


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