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基于CRISPR-Cas12a和λ Red重组酶体系的质粒编辑系统的构建及其应用

耿艺漫  
【摘要】:质粒是研究细菌、病毒和真核生物细胞内遗传信息和通路异质性表达的有用工具。随着分子生物学技术日益发展,已经有许多方法可用于体外、体内质粒克隆(如酶切酶连、PCR、体外重组以及体内重组等),甚至大片段克隆也不再是难题。常用的酶切法受限于酶切位点的存在与否及唯一性,添加酶切位点会引入的额外序列与DNA序列复杂性(如DNA片段过大、序列碱基分布及含量等)相关的扩增困难,以及应用于构建质粒文库时的操作复杂、耗时长。重组技术一定程度上解决上述问题。重组技术是一种基于核酸同源重组原理,利用噬菌体重组蛋白促进寡核苷酸或线性DNA介导的体内同源重组技术,已广泛应用于质粒、细菌人工染色体质粒和多种原核生物基因组DNA的改造,包括碱基突变、缺失或插入。鉴于其重组效率相对较低,需要添加筛选标记(如抗生素)来增加重组效率,而后去掉筛选标记则需利用两步法或引入序列特异性重组酶切除抗性标签(抗性基因两边有同向的两个短的DNA序列可以被特定的重组酶识别),切除后仍会留下一个短的能够被重组酶识别的DNA序列,这种重组操作更复杂且耗时长,很难得到一个真正的无痕突变株。此外,重组质粒形成多聚体形式或是同一细胞内重组质粒与亲本质粒的并存,也限制了其应用(尤其是多拷贝质粒)。为解决上述问题,重组工程偶联CRISPR-Cas系统是一种简单有效的方式。RNA引导的CRISPR-Cas内切酶系统是原核生物的一种适应性免疫系统,最近发展成一种高效的基因编辑工具。Cas12a(亦称为Cpfl),属于Ⅱ类Ⅴ型CRISPR系统内切酶,是一种双重核酸酶,可切割RNA使之形成成熟的向导crRNA,亦可识别PAM区(5'-YTN-3')并在crRNA引导下切割靶向DNA。CRISPR-Cas12a系统被广泛应用于对细菌、植物以及哺乳动物等诸多物种进行基因编辑。我们实验室前期已利用CRISPR系统偶联λ Red重组系统在大肠杆菌、鼠疫杆菌以及分枝杆菌中实现基因组编辑操作,本研究进一步建立体内改造质粒的系统,并利用该系统在pUC质粒和BAC质粒中进行例如基因缺失、点突变、替换和插入等无缝修饰,操作简单且效率高达90%同时不需要选择性标记。此外,我们还证明可有效地在化学法制备的细胞中对质粒进行编辑。我们以包含鼠肝炎病毒基因组的质粒pBAC-JHMVIA为靶标质粒,将带有50 bp同源臂的GFP基因替换鼠肝炎病毒基因组上的基因NS4,形成的质粒pBAC-JHMVIA-GFP2感染星形胶质瘤细胞,不仅诱导细胞形成胞膜融合,还可以检测到GFP信号;针对嗜热链球菌的Cas9Sth1的PAM序列(NNAGAAW),我们利用质粒编辑系统构建了一个含7个连续随机突变碱基的质粒文库,库容量达80%左右。总之,我们建立了一种简单高效的体内质粒编辑方法,可为研究细菌、病毒和真核生物的各种质粒提供一种可供选择的改造策略。我国结核病疫情严重,是全球结核病高负担国家之一。当前,耐药结核病的广泛流行已成为我国结核病防控重点关注的问题。针对现状,研发新的有效抗结核药物迫在眉睫。广泛分布于原核生物基因组的毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxinsystem,TA)可调节细菌的适应性反应,与持留菌、耐药菌及潜伏性感染的形成有关。非致病性分枝杆菌中如耻垢分枝杆菌中有4对TA,海分枝杆菌只有1对TA,而致病性结核分枝杆菌有约80对TA,其中,都有哪些TA与结核菌致病性相关以及参与耐药菌株形成尚不得知。由于结核分枝杆菌生长缓慢(大约16-24小时复制一代),致病性(需要在3级生物安全实验室进行操作)以及会出现高频率的异常重组现象,导致对结核分枝杆菌的基因操作复杂、耗时长而且无法得到一个真正的无痕突变株,限制结核分枝杆菌的研究。研究人员一直尝试将CRISPR-Cas系统应用于结核分枝杆菌的基因编辑,CRISPRi系统可通过突变失活的dCas9蛋白经由sgRNA导向并结合至靶基因处,从而抑制RNA聚合酶起始及延伸沉默靶基因表达;本研究通过上述质粒编辑系统,将96个靶向结核分枝杆菌TA基因的靶序列克隆至质粒PLJR965的sgRNA表达盒,形成靶向TA基因的CRISPRi质粒文库。随后将该质粒文库电转至结核分枝杆菌中,获得靶向结核TA的结核分枝杆菌的CRISPRi文库(诱导组:脱水四环素诱导dCas9Sthl和sgRNA表达;未诱导组:无脱水四环素诱导)通过二代测序分析诱导组与未诱导组之间sgRNA序列相对百分比筛选出可能与耐药相关的 TA 基因:Rv1130c-1102c,Rv1991A-1991c,Rv2654c-2653c,Rv2865-2866,Rv3357-3358和Rv0059-0060。下一步计划构建上述TA基因的敲除株和过表达质粒,进一步验证是否与耐药相关并探究其参与耐药的分子机制,为寻找新的耐药靶点奠定基础。


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