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E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究

杨圆圆  
【摘要】:背景和目的:乳腺癌是影响全世界女性健康的头号杀手,据全国肿瘤登记中心统计,2015年全国乳腺癌发病病例约26.9万例,死亡病例约7.0万例。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是其中恶性程度最高的一个分型,预后极差,且极易发生脑部和内脏的转移。全球范围内每年有超过50万人死于乳腺癌转移,其中位生存期仅有2到3年。临床上对于TNBC的治疗手段以手术和化疗为主,但对于已发生转移的患者手术切除明显是不现实的,化疗药物也很难起到很好的效果,并常常伴有副作用。随着免疫治疗的迅速发展,CAR-T、TCR-T、肿瘤疫苗、双功能抗体、免疫检查点抑制剂等多种治疗方案应用于恶性肿瘤的治疗中,并取得了喜人的临床效果。其中又以PD-1/PD-L1通路阻断剂在实体瘤的疗效最为突出。对TNBC的肿瘤微环境研究表明,TNBC是一种高异质性和突变负荷的肿瘤类型,且有着较多的淋巴细胞浸润和PD-L1表达。这样的免疫微环境对于PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用是非常有益的。随着临床适应症的扩展和患者范围的扩大,PD-1抗体的不良反应事件逐渐增多,且对部分患者临床响应率偏低也一直是饱受诟病的问题。瘤内局部给药有着避免PD-1抗体全身暴露、减少副作用、提高药物利用度、增强免疫反应的优势。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类来源广泛免疫原性低,具有多项分化潜能的成体干细胞。多项研究表明,MSCs可以有效地向肿瘤原位和微小转移灶归巢,这些特性使其成为基因治疗的理想载体。根据上述理论和研究基础,我们设计双特异性的融合蛋白CD3-HAC(HAC为文献中报道的具有高亲和能力的PD-1胞外区突变序列),并以人端粒酶启动子(hTERTp)调控其表达,将其克隆到腺病毒载体中,利用E1A修饰的MSCs于肿瘤部位包装分泌腺病毒,并感染肿瘤细胞。继而在肿瘤原位激活T细胞,发挥免疫杀伤功能。方法:采用PCR、重叠PCR(overlap PCR)、酶切、连接等方法构建pAd-hTERT-CD3-HAC,pAd-hTERT-CD3scFv,pAd-hTERT-HAC 腺病毒表达载体,pcDNA3.1(+)-CD3-HAC,pcDNA3.1(+)-CD3scFv,pcDNA3.1(+)-HAC 真核表达载体,以及pAdTrack和pLentiR空载对照载体,并经测序验证其基因序列的正确性。将表达载体 pcDNA3.1(+)-CD3-HAC,pcDNA3.1(+)-CD3scFv,pcDNA3.1(+)-HAC 瞬时转染至293T细胞,收集培养上清并通过His标签亲和层析对产物进行纯化,通过Western blot检测培养上清及纯化后样品中目的蛋白的表达。通过WB、免疫荧光、流式分析,检测CD3-HAC蛋白的表达及其与靶细胞的结合。利用活细胞工作站监测PBMC与AdCD3-HAC感染的MDA-MB-231乳腺癌靶细胞之间经典相互作用,乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放法定量检测PBMC对不同靶细胞的杀伤水平,流式检测淋巴细胞表面活化分子的表达,ELISA检测细胞因子的分泌,CellTrace Far Red检测淋巴细胞增殖等,从不同角度全面分析CD3-HAC蛋白的生物学功能。通过ELISA及细胞凋亡检测证实HAC对PD-1/PD-L1通路的阻断作用。联合低剂量5-FU,检测其对腺病毒感染的增敏及免疫杀伤的促进作用。使用Bio-Rad QX200数字微滴PCR系统检测不同时间点腺病毒在MSC.Adtrack.E1A胞内及上清的绝对拷贝数,绘制腺病毒复制时间曲线;采用细胞透射电镜证明腺病毒颗粒在MSC.Adtrack.E1A中的存在。建立MDA-MB-231乳腺癌转移小鼠模型,尾静脉注射MSC.AdLuc.E1A或MSC.AdLuc.LentiR.至荷瘤小鼠体内,IVIS成像系统观察其向肿瘤部位的归巢情况。尾静脉注射MSC.Adtrack.E1A或MSC.AdCD3-HAC.E1A,检测CD3-HAC蛋白对PBMC的体内激活作用。最后,利用MDA-MB-231乳腺癌肺转移小鼠模型评价MSC.AdCD3-HAC.E1 A治疗系统单独或联合低剂量5-FU对肿瘤生长的抑制作用,并绘制生存曲线。结果:成功构建 pAd-hTERT-CD3-HAC,pAd-hTERT-CD3scFv,pAd-hTERT-HAC,pcDNA3.1(+)-CD3-HAC,pcDNA3.1(+)-CD3scFv,pcDNA3.1(+)-HAC,pAdTrack及pLentiR载体,经测序证明其基因序列正确。免疫荧光及流式分析,结果表明CD3-HAC双特异性融合蛋白CD3-HAC表达于乳腺癌细胞,并成功结合于细胞表面。活细胞工作站监测PBMC与AdCD3-HAC感染的MDA-MB-231乳腺癌细胞之间的相互作用。LDH释放实验结果表明CD3-HAC能够特异性介导T细胞对PD-L1阳性细胞的杀伤。HAC功能蛋白可以阻断PD-1与PD-L1相互作用。联合低剂量5-FU可增敏腺病毒对靶细胞的感染,进而促进PBMC的细胞毒作用。腺病毒AdTrack及慢病毒LentiR.E1A共感染HUMSC后,腺病毒在MSCs中复制及包装,最终裂解MSCs并释放具有感染能力的完整腺病毒颗粒。成功建立MDA-MB-231肺转移小鼠模型,经基因修饰的MSCs在尾静脉注射24小时后即可归巢至肿瘤局部,然后能够产生新的病毒并感染肿瘤细胞,实现体内CD3-HAC融合蛋白介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤。体内抑瘤实验证明,MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC单独或5-FU联用组,小鼠的生存期明显延长。结论:本课题建立了由经过基因修饰的MSCs运载CD3-HAC双特异性融合蛋白的局部靶向治疗系统,并与5-FU联用增强抗肿瘤作用。在增强免疫应答的同时,避免了 PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂的副作用,为恶性转移肿瘤的治疗提供了新的思路。


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1 杨圆圆;E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究[D];北京协和医学院;2018年
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