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氯喹抗肿瘤新机制探究:调动巨噬细胞依赖的抗肿瘤免疫

陈德高  
【摘要】:目的:2018年诺贝尔生理学与医学奖颁发给了将抑制免疫负向调控用于肿瘤治疗的研究,让肿瘤免疫治疗成为时代的新宠。当前肿瘤免疫疗法主要有针对免疫检查点的PD-1或者CTLA-4抗体、CAR-T细胞等,这些均是以激活T细胞诱导适应性免疫应答为基础。而肿瘤免疫微环境中存在着大量的固有免疫细胞,它们能第一时间识别和攻击肿瘤细胞,对这些固有免疫细胞进行研究有助于深入认识肿瘤免疫抑制,开发新型免疫治疗方式。这其中以巨噬细胞为代表,极其众多的巨噬细胞在肿瘤免疫微环境中不但不发挥其原始的吞噬肿瘤细胞、提呈肿瘤抗原以及杀伤肿瘤细胞的作用,反而被肿瘤细胞教育成为了所谓的M2型肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),促进肿瘤生长、转移以及免疫逃逸。因此,靶向M2型TAMs,使其成为抗肿瘤的M1型巨噬细胞,重塑肿瘤免疫微环境,促进T细胞等的抗肿瘤免疫,将为肿瘤免疫治疗开辟一条新的道路。方法:体外培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞,分别运用LPS/IFN-γ极化诱导M1型巨噬细胞、IL-4极化诱导M2型巨噬细胞,分析两类巨噬细胞溶酶体pH值、数量等的差异;选取溶酶体特异性抑制剂:氯喹(Chloroquine,CQ),靶向M2型巨噬细胞溶酶体,从而改变巨噬细胞表型;运用特异性小分子抑制剂和CRISPR/Cas9技术解析CQ诱导巨噬细胞表型变化的机制;同时利用细胞能量代谢分析仪检测CQ对巨噬细胞代谢模式的影响,运用CHIP-QPCR技术探究代谢模式改变的机理;运用小鼠皮下黑色素瘤和肝癌腹水模型验证CQ的抗肿瘤作用,通过巨噬细胞体内清除实验探索CQ抗肿瘤作用与巨噬细胞的关系;进一步在OVA-B16与OT-I CD8 T细胞模型中研究CQ与肿瘤抗原特异性T细胞杀伤肿瘤的关系;最后分析CQ治疗肿瘤后的肿瘤免疫微环境,联合清除Treg或者MDSCs进一步增强抗肿瘤免疫。结果:(1)CQ介导T细胞依赖的抗肿瘤反应。首先,我们在野生型小鼠皮下黑色素瘤和肝癌腹水模型中证实了 CQ具有明显的抗肿瘤效果,但是在T细胞缺陷的裸鼠或者CD3中和抗体清除的野生型小鼠上建立的黑色素瘤和肝癌动物模型中,CQ失去了抗肿瘤效应,这说明CQ发挥抗肿瘤反应需要T细胞参与。(2)CQ介导巨噬细胞依赖的T细胞抗肿瘤反应。进一步的体内外实验研究发现CQ可能不能直接促进T细胞增殖、活化等,亦可能不能促进树突状细胞的成熟和活化;但是CQ在巨噬细胞清除的黑色素瘤和肝癌动物模型中也失去了抗肿瘤效应,这说明CQ所引起的T细胞抗肿瘤免疫依赖巨噬细胞。另外,CQ可以诱导肿瘤浸润性CD8+T细胞分泌更多的IFN-γ,同时增强肿瘤特异性T细胞的肿瘤杀伤能力。(3)CQ诱导M2型TAMs表型向Ml型转变。既然CQ抗肿瘤效应依赖巨噬细胞,我们体外实验也证实了 CQ能够逆转M2型巨噬细胞表型向M1型转变,更重要的是,CQ也能逆转体内的TAMs,同时CQ再教育的M2-TAMs细胞还能促进T细胞增殖。除此之外,CQ还能再教育人单核细胞来源的M2型巨噬细胞向M1型转变。(4)CQ活化p38和NF-κB信号诱导M1型巨噬细胞。通过对巨噬细胞活化经典信号MAPK的检测,结合特异性小分子抑制剂和CRISPR/Cas9基因敲除技术,发现CQ利用p38/NF-κB信号诱导M1型巨噬细胞表型。(5)溶酶体释放的钙离子触发p38/NF-κB信号。更进一步的,对CQ特异性靶点溶酶体的研究发现,CQ能够升高M2型巨噬细胞溶酶体的pH值,触发钙离子通过Mcoln1通道释放至细胞浆,以此激活了 P38/NF-κB信号通路。(6)溶酶体释放的钙离子活化TFEB重塑巨噬细胞代谢模式。经过代谢模式检测发现,CQ处理的M2型巨噬细胞代谢方式向以糖酵解为主的M1型转变,这种变化是由于胞浆钙离子促进TFEB进入细胞核,TFEB转录因子启动糖酵解代谢通路关键酶而引起的。(7)CQ逆转TAMs改善肿瘤免疫抑制微环境。CQ引起巨噬细胞依赖的抗肿瘤效果诱发肿瘤免疫微环境中的另外两大类免疫抑制细胞MDSCs和Treg降低,同时CQ联合低剂量环磷酰胺或者CD25中和抗体彻底清除Treg进一步放大抗肿瘤效果,联合Gr-1中和抗体清除MDSCs亦能扩大CQ的抗肿瘤效应。结论:我们发现,CQ作为一个“老药”,可以特异性作用于M2型TAMs的溶酶体,升高溶酶体pH值,诱导溶酶体腔内的钙离子释放到细胞浆,一方面触发p38/NF-κB信号通路,使得M2-TAMs表型向M1型转换,另一方面活化TFEB,调控M2-TAMs的代谢模式向M1型的糖酵解方式转变。此时,CQ逆转的M2型TAMs不仅具有M1表型,同时还有糖酵解提供能量用以持续维持其抗肿瘤功能。这样的巨噬细胞在肿瘤微环境中促进T细胞发挥抗肿瘤作用,尤其是增强肿瘤特异性T细胞对肿瘤的杀伤,同时还重塑肿瘤免疫微环境,解除免疫抑制,进一步放大抗肿瘤免疫效果。


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