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阳离子多糖精胺-普鲁兰在肿瘤治疗中的作用与机理研究

谢丽菲  
【摘要】:目的:来源于动植物、微生物的天然多糖具有生物相容性好、易修饰等优点,通过引入正电荷基团,可以获得多种阳离子多糖。越来越多的研究结果显示,阳离子多糖不仅可作为核酸、蛋白/多肽及化疗药物的递送载体,用于抗肿瘤研究;其本身还具有免疫刺激作用,某些阳离子多糖已被证实可促进树突状细胞成熟或影响巨噬细胞的表型。在众多阳离子多糖中,通过精胺分子修饰得到的阳离子化精胺-普鲁兰(Pullulan-Spermine,PS)具有脱唾液酸糖蛋白受体靶向性,在介导肝细胞、内皮细胞和神经细胞的基因转染方面展现出独特的优势;我们在前期工作中也观察到,在难转染的白血病细胞上,PS也可有效介导对耐药相关靶基因的RNA干扰。恶性肿瘤包含实体肿瘤和血液肿瘤,对于前者来说,肿瘤组织中的免疫抑制性M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophage,TAM)是肿瘤免疫治疗的重要靶点之一,而血液肿瘤中白血病的治疗靶点则多为突变基因。基于前期工作的基础及领域内相关研究背景,本课题的目的是合成阳离子多糖精胺-普鲁兰(PS),系统研究其对巨噬细胞的作用与分子机制,及其在乳腺癌肿瘤细胞荷瘤小鼠上的抗肿瘤免疫治疗功效;并以PS为siRNA载体,研究其在慢性髓系白血病细胞中介导BCR-ABL基因沉默的功效。方法:以小鼠巨噬细胞RAW 264.7作为M0型巨噬细胞,采用脂多糖(LPS)联合IFN-γ(LPS+IFN-γ)或IL-4诱导M0型巨噬细胞向M1或M2型极化。采用细胞活性检测试剂(CCK-8)检测PS、PS联合脂多糖(LPS)(PS+LPS)对巨噬细胞活性的影响,检测PS与siRNA复合物(PS-siRNA)对慢性髓系白血病细胞系K562、MEG-01和Ku812活性的影响。应用流式细胞术检测巨噬细胞对PS、PS+LPS的摄取,以及K562、MEG-01和Ku812细胞对PS-siRNA的摄取。采用激光共聚焦显微镜观察PS在巨噬细胞中的定位。通过Real-time PCR和流式细胞术分析PS和PS+LPS 对巨噬细胞表型标志物(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、iNOS 和 CD206)、抗原提呈相关分子(MHC-I、MHC-II和CD86)、Toll样受体(TLRs)的表达影响;通过western blot法检测TLRs下游信号通路蛋白MyD88、MAPKs(Erk、JNK、P38)、Akt、c-Jun 以及 NF-κB 的表达和活化。应用 Real-time PCR 以及 western blot法分别从基因和蛋白水平检测PS在三种CML细胞中介导BCR-ABL基因沉默的效率,应用流式细胞术检测经PS-BCR-ABL siRNA处理后,三种CML细胞的增殖和分化。建立乳腺癌小鼠模型,通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜检测肿瘤组织中TAM表型变化,通过流式细胞术、酶联免疫吸附实验和T细胞杀伤实验检测T细胞活化,应用组织病理观察肝脏和肺组织中肿瘤转移,应用免疫组化方法检测肿瘤组织中CD31、MMP-9的表达,监测小鼠肿瘤生长及生存期。结果:PS可被M0型或M2型巨噬细胞摄取并定位于溶酶体,在正常培养基和含有IL-4的培养基中,均可显著上调M0和M2型巨噬细胞TNF-α、iNOS和下调CD206的基因表达,同时,上调抗原提呈相关蛋白MHC-I、MHC-II和CD86的水平,使两种表型巨噬细胞均向M1型极化。机理研究表明,PS通过促进巨噬细胞TLR1、TLR3和TLR4的表达,活化MyD88,引起Akt、Erk和JNK分子磷酸化,最终促进NF-κB进入细胞核中转录。在乳腺癌小鼠模型中,PS可以促进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M1型极化,显著增加脾脏CD4~+T细胞和CD8~+T细胞数量,并提高其对肿瘤细胞的特异性杀伤能力,有效降低转移相关蛋白酶MMP-9和血管内皮细胞标志物CD31的表达,减少肿瘤内部血管生成,抑制肿瘤生长和向肺部和肝脏的转移,延长小鼠生存期。PS本身不改变IL-1β、IL-6、IL-12的表达,但可以增强LPS介导的对巨噬细胞的免疫刺激作用,进一步提高IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、iNOS的表达,在乳腺癌小鼠模型上提高LPS的免疫治疗效果。PS可以在三种CML细胞上介导BCR-ABL siRNA的有效转染。N/P比为2.5的PS-BCR-ABL siRNA被三种CML细胞摄取的阳性率达到98%以上,在24h时达到最佳干扰效果,在有血清条件下,对K562、MEG-01和Ku812干扰效率分别是55%、38%和29%,无血清条件下为82%、46%和62%,同时,显著下调BCR-ABL蛋白的表达,抑制三种CML细胞的增殖,诱导K562细胞向红系分化及MEG-01细胞向红系和巨系分化结论:PS可以激活TLR1、TLR3和TLR4介导的信号通路,提高巨噬细胞抗原提呈能力,促进巨噬细胞向M1型极化,在乳腺癌小鼠模型中,通过逆转TAM表型,恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫,抑制小鼠肿瘤生长和转移,显著延长小鼠生存期,且PS与LPS联合应用后表现出协同治疗效果。PS作为CML细胞基因转染载体,可以有效干扰BCR-ABL的表达,抑制细胞增殖,促进细胞分化,后续在白血病细胞基因功能研究以及基因治疗中具有潜在的应用前景。


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