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红树林和沙漠环境药用放线菌资源勘探及新物种分类学研究

李飞娜  
【摘要】:细菌耐药问题日趋严重,亟需新型高效的抗生素,而当前新型优质抗生素药物匮乏,主要原因之一是已知菌和素的重复筛选所导致的发现成本升高和效率低下。放线菌是抗生素生产的主力军,其物种多样性是化合物多样性的基础,开发菌源,丰富药用放线菌资源,可从源头上增加新型抗生素的发现机率。栖息于特殊环境的放线菌以往研究较少,因其独特的基因类型和代谢机制,目前已成为药用放线菌资源开发的热点。基于上述背景,本研究选择红树林和沙漠这两种特殊环境,采用经典的放线菌分离方法,开展了药用放线菌资源勘探。由于实验室可培养的微生物不足自然界的1%,为有效挖掘剩余99%的微生物资源,本研究还尝试采用原位培养技术俘获红树林土壤中未培养和难培养微生物。最后针对勘探过程中发现的新物种,重点开展了多相分类学鉴定。主要工作内容如下:一、对澳门路氹城生态保护区的红树林植物进行了内生放线菌的分离纯化,并从中选取代表菌株开展抗菌活性筛选。该研究从12份植物样品中共分离得到192株内生放线菌,分布于8目17科30属,优势菌属为链霉菌属;其中22株为潜在新物种,4株新物种被鉴定发表;抗菌活性筛选结果表明,82株发酵菌株中50株具有抗菌活性,其中强抗菌活性(抑菌圈直径20 mm)菌株6株,具有明显抗菌活性(抑菌圈直径12 mm)的稀有放线菌21株,具有抗菌活性的潜在新物种8株,值得开展化学研究的候选菌株28株,为评价其抗菌潜力,分析了其中5株菌的次级代谢产物生物合成基因簇。二、采用原位培养技术俘获福田红树林和茅尾海红树林土壤中未培养和难培养放线菌,并从中选取代表菌株开展抗菌活性筛选和作用机制检测。从35份原位培养样品中分离得到367株放线菌,分布于7目12科30属,优势菌属为微杆菌属,其中9株为潜在新物种。抗菌活性筛选结果表明,85株发酵菌株中45株具有抗菌活性,其中强抗菌活性(抑菌圈直径20mm)菌株10株,具有明显抗菌活性(抑菌圈直径12 mm)的稀有放线菌13株,具有抗菌活性的潜在新物种2株。双荧光蛋白报告系统对85份发酵液酯相提取液的筛结果表明,2株链霉菌的次级代谢产物可抑制蛋白翻译。根据上述结果,确定25株菌为化学研究候选菌株,对其中1株链霉菌开展次级代谢产物生物合成基因簇分析,发现其具有产生多种抗菌活性物质的潜力,目前本课题组博士生已从该菌中分离得到3个活性化合物。三、对塔克拉玛干沙漠植物样品进行内生放线菌的分离纯化,并从中选取代表菌株开展抗菌活性筛选和作用机制检测。从15份植物样品中得到320株内生放线菌,分布于9目14科23属,优势菌属为链霉菌属,其中19株为潜在新物种,目前已经确定了 3株新物种的分类地位;抗菌活性筛选结果表明,75株发酵菌株中47株具有抗菌活性,其中具有强抗菌活性(抑菌圈直径20 mm)的菌株6株,具有明显抗菌活性(抑菌圈直径12 mm)的稀有放线菌10株,具有抗菌活性的潜在新物种5株;双荧光蛋白报告系统对75份发酵液酯相提取液的筛选结果表明,2株链霉菌的次级代谢产物可抑制DNA合成,2株链霉菌的次级代谢产物可抑制蛋白翻译。根据上述结果,确定19株为化学研究候选菌株,对其中4株菌进行了次级代谢产物生物合成基因簇分析,预测了其产生抗菌活性物质的潜力。在基因挖掘指导下,本课题组博士生已从2株候选菌株中分离得到14个活性化合物,其中2个为新化合物。四、选取4株澳门红树林植物内生菌(1T4Z-3、4Q3S-7、5T4P-12-1和2T4P-2-4)和3株塔克拉玛干沙漠植物内生放线菌(11W25H-1、8H24J-4-2和9W16Y-2)开展了潜在新物种的多相分类鉴定,确定了上述7株菌的分类地位,分别命名为Amnibacterium endophyticum sp.nov.、Marmoricola mangrovicus sp.nov.、Mangrovicella endophytica gen.nov.,sp.nov.、Aureimonas endophytica sp.nov.、Labedella phragmitis sp.nov.、Labedellapopuli sp.nov.和 Aeromicrobium endophyticum sp.nov.。本研究从红树林和沙漠生境中共分离得到879株放线菌,分布于9目20科54属;对242株放线菌进行抗菌活性筛选,共获得142株具有抗菌活性的菌株,其中强抗菌活性(抑菌圈直径20 mm)菌株共22株,具有明显抗菌活性(抑菌圈直径12 mm)的稀有放线菌共44株,具有抗菌活性的潜在新物种共15株;对160株放线菌进行基于抗菌作用机制的筛选,获得4株可抑制蛋白翻译的链霉菌和2株可抑制DNA合成的链霉菌。根据上述实验结果,确定72株为化学研究候选菌株,并对其中10株菌进行次级代谢产物生物合成基因簇分析,预测了其产生抗菌活性物质的潜能。目前本课题组博士生从本研究获得的3株化学候选菌株,分离得到了 17个活性化合物,其中2个为新化合物。另外,本研究共分离得到50株潜在放线菌新物种,7株已被鉴定发表。文献调研发现,截至2020年3月,红树林植物内生放线菌新物种共13个,其中有4株来自本研究的澳门红树林植物内生放线菌;2017-2020年1月,沙漠植物内生放线菌新物种共5个,其中有3株来自本研究的塔克拉玛干沙漠植物内生放线菌。本研究结果揭示红树林和沙漠生境中孕育着丰富且新颖的放线菌资源,是新抗生素发现的宝库。同时,采用原位培养技术可为天然产物研究提供更加丰富优质的菌源,值得深入研究。


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