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功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究

高佳佳  
【摘要】:食管癌(Esophageal cancer,ECA)是我国致死率排名第四位的恶性肿瘤,其中约90%的组织学类型为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。食管癌早期诊断难,患者就诊时多为中晚期,预后差,探讨促进食管癌进展的分子机制对食管癌的诊断和治疗具有重要意义。富含嘌呤元件结合蛋白α(Purine-rich element binding protein alpha,PURα)是PUR蛋白家族成员之一,具有保守的核酸结合结构域,参与DNA复制、转录和修复以及RNA转运和翻译等多种生物学功能。PURα蛋白的异常表达除了参与神经系统疾病的发生外,近年发现PURα还参与一些恶性肿瘤的增殖调控,然而,PURα在食管癌中的表达和作用机制尚不清楚。本研究,首先探讨了 DNA结合蛋白PURα调控食管癌进展的分子机制。首先,分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中PURA基因在食管癌组织中mRNA表达水平,免疫组化分析评估PURα蛋白在食管癌中的表达水平,分析食管癌组织中PURα的表达水平与患者临床病理参数和预后的相关性,以及观察PURα对食管癌体外和体内肿瘤生物学表型的影响。通过构建稳定过表达和敲降PURα的食管鳞癌细胞系,利用CCK-8和平板克隆实验、划痕愈合和Transwell实验检测PURα对体外培养细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;建立裸鼠皮下移植瘤和尾静脉注射肝肺转移瘤模型,检测PURα对体内肿瘤增殖和肝肺等脏器转移能力的影响。进一步,探讨了 PURα影响食管癌进程的分子机理。对过表达和敲降PURA基因的食管鳞癌细胞的RNA-seq分析,发现受PURA调控的信号通路和差异表达基因。利用qPCR、Western blot和免疫荧光分析验证候选通路和基因,双荧光素酶报告基因和ChIP实验探究PURα对候选基因转录调控的影响,利用回复性实验验证候选基因影响PURα介导的食管癌表型改变中的作用。通过以上实验,我们发现,PURA mRNA和蛋白水平在食管癌组织中高表达,PURα高表达与食管癌患者的淋巴结转移和AJCC分期呈正相关(P0.05),且PURα高表达患者生存期更短(P0.05),提示PURα促进了食管鳞癌进展和不良预后。体内外功能实验发现,PURα促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进食管癌细胞的裸鼠致瘤和肝、肺等远处器官的转移能力。解析其机制,RNA-seq分析结果提示PURα参与细胞粘附分子和细胞外基质-受体相互作用等通路的调控,影响多个上皮和间质相关基因的表达;PURα下调E-钙黏蛋白(E-Cadherin,CDH1)、上调N-钙黏蛋白(N-Cadherin,CDH2)和波形蛋白(Vimentin,VIM)的表达,诱导食管癌细胞发生上皮-间叶转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。深入的机制分析表明,PURα可以与Snail家族锌指转录因子2(Snail family transcriptional repressor 2,SNAI2)基因启动子区-896至-431 bp的序列结合,促进SNAI2的转录活性,上调Snail2蛋白的表达。敲降SNAI2可抑制PURα诱导的EMT表型,降低食管癌细胞的运动、侵袭和转移的能力。总之,本研究发现PURα通过与SNAI2基因启动子区域结合,促进SNAI2转录活性,上调Snail2的表达,诱导食管鳞癌细胞发生EMT,进而促进食管鳞癌的增殖、侵袭和迁移,促进肿瘤进展。该研究为食管癌的诊断和治疗提供了新的分子靶标。肝癌(Liver cancer)是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在所有的恶性肿瘤中排名第四位,致死率高,预后差。RuvB-like 2(RUVBL2)蛋白属于与多种细胞活性相关的保守ATPase(AAA+)蛋白亚家族,其保守的WalkerA和B结构域可以参与ATP的结合和水解。有文献报道RUVBL2可能参与肝癌的发生,然而,RUVBL2的表达、调控和临床意义尚未系统性地在大规模肝癌临床样本中分析和验证。本实验室前期研究发现,RUVBL2蛋白在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma.HCC)中表达上调,本研究探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能和表达调控机制。前期用免疫组化分析了 153例肝癌患者组织芯片的RUVBL2表达水平,在此工作基础上,我们对TCGA数据库中收录的371例肝癌患者的转录组测序数据、体细胞拷贝数改变数据和DNA甲基化数据进行整合分析,探究RUVBL2在肝癌中表达上调的原因和临床意义。进而在体外培养的肝癌细胞上探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能。在HepG2和Huh7肝癌细胞中瞬时敲降RUVBL2,利用CCK-8和平板克隆实验,以及Transwell实验检测RUVBL2对体外细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响:Western blot检测RUVBL2对热休克蛋白90(HSP90)、细胞分裂周期蛋白37(CDC37)、丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和细胞外调解蛋白激酶(ERK)信号通路的影响。结果发现,RUVBL2基因启动子低甲基化、拷贝数增加,MYC基因扩增和CTNNB1基因突变可能参与调控RUVBL2在肝癌中表达水平增高。高水平的RUVBL2 mRNA与肝癌患者较短的无复发生存时间(Recurrence-free survival time.RFS)相关,但不影响总生存时间(Overall survival time,OS)。敲降RUVBL2肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低,并抑制HSP90-CDC37、AKT和ERK的磷酸化。以上结果提示,RUVBL2在肝细胞肝癌中的表达受到转录水平和表观遗传水平的调控。RUVBL2可能通过激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,提示RUVBL2是肝癌的一个潜在预后预测标志和治疗靶标。本实验室前期采用全基因组关联分析(Genome-wide association analysis.GWAS)鉴定到位于2q33.1区域的5个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点与中国汉族人群食管鳞癌的发生显著相关。本研究还探讨了一个位于CASP8基因内含子中的主效位点调控食管癌易感性的机制。发现该位点通过影响剪接因子的结合而参与调控CASP8基因的选择性剪接,产生一个新的CASP8剪接亚型Caspase-8X。新剪接亚型编码C端催化结构域缺失的Caspase-8截短体蛋白Caspase-8X,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,与食管癌发生发展相关。该研究发现了一个参与调控食管鳞癌发生的新机制,为认识食管鳞癌癌变机理积累了科学数据。


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