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抗乳腺癌人源单链抗体CM1-scFv的表达与活性分析

段琼文  
【摘要】:乳腺癌是妇女发病率最高的恶性肿瘤之一,外科手术、放射与药物治疗均为乳腺癌的重要治疗手段。药物疗法是乳腺癌综合治疗的重要组成部分。单克隆抗体有高度特异性,探索乳腺癌的抗体靶向治疗有重要的临床价值。由于人体对鼠源单克隆抗体能产生人抗鼠抗体反应(HAMA),人源单克隆抗体成为单克隆抗体应用于临床治疗的一个关键因素。 1991年中国医学科学院基础医学研究所王树蕙教授利用转移性乳腺癌患者腋窝淋巴结淋巴细胞与人鼠杂合骨髓瘤SMH-D33融合,筛选出一株能稳定分泌抗乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,CM1。据报道该抗体重链类型为人μ链,轻链类型为鼠κ链。免疫组化、裸鼠移植瘤放射免疫显像显示其有较强特异性。与平阳霉素构建的化学偶联物有高于游离平阳霉素的抑瘤率,表明CM1单克隆抗体有可能发展成为抗肿瘤药物的载体将药物导向肿瘤组织。 力达霉素(Lidamycin,LDM)是本研究室从一株放线菌(Streptomyces globisporus sp.C-1027)代谢产物中获得的对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的大分子肽类抗肿瘤抗生素。力达霉素的分子由发色团和辅基蛋白组成,发色团具有细胞杀伤活性,辅基蛋白起保护稳定发色团的作用,二者可拆分与重建。重建的力达霉素与天然状态力达霉素具有相同高度的活性。 本研究鉴定了抗体轻链来源,分别构建了CM1单链抗体和单链抗体力达蛋白融合蛋白的原核表达载体,pET-scFv,pET-scFv-LDP。pET-scFv转化大肠杆菌E.coli BL21star~(TM)(DE3),经诱导,纯化,复性得到纯化的scFv,研究其免疫活性,探讨进一步开发融合蛋白的价值。 一、抗乳腺癌人源单链抗体CM1-scFv的表达、纯化及活性分析 采用有限稀释法对杂交瘤细胞株CM1进行亚克隆化培养,取上清经间接ELISA检测出抗体高分泌亚克隆4A7和4A8。扩大培养4A7和4A8,收集上清经硫酸胺沉淀浓缩后进行免疫双扩散分析,证明CM1单克隆抗体的轻链来源于小鼠,含人轻链基因的染色体已经丢失,从杂交瘤中克隆出人源化轻链基因的可能性小。于是从已有的含有该单克隆抗体重链轻链可变区的质粒出发构建含组氨


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