尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒分子流行病学研究及L1序列多态性分析和在原核表达体系中的表达

【摘要】：从临床尖锐湿疣(condyloma acuminata，CA)的人乳头瘤病毒(human papillomavims，HPV)感染的分子流行病学研究入手，并对L1晚期基因进行克隆和序列分析，以跟踪HPV感染的传播途径，分析HPV感染的表型和基因型之间的关系，并筛选有代表性的分离株进行重组疫苗的构建，表达和免疫学分析。 本文采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法从尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒，设计通用引物MY09／MY11，扩增HPV晚期基因L1区的一段保守序列，并通过限制性片断长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型。对于难以通过酶切鉴定的PCR产物，构建重组测序质粒，检索GenBank进一步分型鉴定。结果发现正常患者HPV6型为主要感染型别，其次是HPV11型。HPV6型患者年龄较HPV11和HPV6+HPV11型更低；而高龄患者和免疫抑制患者则以HPV11+HPV6的混合感染和HPV11的感染为主。部分患者还检出HPV16型与其他型的混合感染，均发生于女性患者，而一般存在于正常生殖道组织的HPV53个别也可导致尖锐湿疣的发生。 根据不同临床特征选择主要致病型HPV6型八个分离株，扩增L1晚期基因，构建重组测序质粒pMD18-T-L1，双脱氧法测序并分析L1区的核苷酸和氨基酸序列变异状况。结果表明HPV6L1基因序列发生碱基替换的区域主要有四个区，包括SR1(5911～6104)，SR2(6217～6273)，SR3(6540～6661)和SR4(7062～7250)。少数的碱基替换导致错义突变，推导的蛋白质一级结构中有0～3个氨基酸发生变异，但抗原性强弱与原型HPV6基本一致。通过比较，在我院检测的标本HPV6 L1区的基因变异位点与在日本检测的标本有较多的一致，而与欧美地区的标本相比变化较多，这说明HPV6 L1区的亲缘性可能与地理位置的远近有关。而对L1序列的抗原指数、氨基酸表面特征和亲水性特征进行分析预测，发现各HPV6变异株间并无明显的差异，提示HPV6 L1区是该病毒系统发生过程中非常保守的区域，可进一步构建表达载体，表达目的蛋白并比较氨基酸序