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血糖调节相关基因的克隆及其功能的初步研究

常永生  
【摘要】:本研究应用差异显示技术克隆血糖调节相关基因作为糖尿病的候选基因。通过颈静脉—右心房插管技术建立了大鼠血糖自动调节模型,葡萄糖注入大鼠形成短暂高血糖前后,取其骨骼肌进行mRNA差异显示分析。下游3个单锚定引物分别与上游10个随机引物进行30种组合PCR扩增,得到181条差异条带中,狭缝杂交证实葡萄糖上调表达的基因片段56条、下调表达的基因片段18条。选取8条表达上调的EST和9条表达下调的EST进行Northern杂交分析,确认EST-89,EST-62,EST-119为表达上调片段,EST-17,EST-76,EST-124为表达下调的EST。筛库后得到EST-89的全长cDNA,命名为Fang—1,其全长cDNA为2.3Kb,Genbank收录号为AF399873;EST-76的全长基因命名为Fang—2,全长约0.9kbp,Genbank收录号为AF399874。 Blast软件分析后发现Fang—1在人类有同源基因,GenBank收录号为AK001644,但是该基因功能目前未知。 为了确定Fang—1对哺乳动物细胞糖代谢的影响,将全长Fang—1克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1,转染CBRH7919细胞系,RT-PCR和Northern杂交分析表明Fang—1高表达可以上调胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)的表达。 将Fang—1 cDNA的一段编码区序列克隆到原核细胞表达载体pGEX-4T3中,转化大肠杆菌BL21,应用亲和层析法纯化表达的融合蛋白,并以该蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,其滴度达到1:32万,为进一步研究Fang—1的功能打下了基础。将Fang—1全长编码区融合pEGFP,转染细胞后观察到细胞质和细胞核均有表达。 为了确定细胞内与Fang—1相互作用分子,我们首先构建了大鼠骨骼肌酵母双杂交文库,文库独立克隆数超过10~6,符合文库质量要求。然后将Fang—1编码区分为两段以及全长Fang—1分别克隆到载体pGBKT7作为诱饵蛋白,验证这些蛋白对酵母没有毒害作用和自激活作用。目前正在筛库,鉴定与这些诱饵蛋白相互作用的基因。


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