巨噬细胞集落刺激因子可溶性受体的克隆表达及其相关性研究

【摘要】：根据M-CSF-R结构上的特点合成了针对胞外区前三个结构域的PCR引物。采取异硫氰酸胍一步法，从正常分娩的人胎盘组织中提取总RNA。用3’端引物逆转录合成cDNA第一链，PCR扩增出相应的片段(909bp)，测序结果表明所得基因片段的序列与文献报道几乎完全一致。将此基因片段克隆到原核高效表达载体pGEX-4T-2 BamH Ⅰ／Sal Ⅰ处，使其表达含GST的融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析结果表明在67kD处出现新的条带，蛋白分子量大小与预期值相符。集落形成抑制实验表明部分纯化的融合蛋白对J6-1细胞的生长抑制率可达79.6％。抗体中和实验显示融合蛋白具有与抗M-CSF-R单抗的结合活性；表达产物还能抑制人肝癌细胞系SMMC 7721和人白血病细胞系HL60的生长，呈剂量和时间依赖性，表明克隆的M-CSF-R基因片段表达产物具有M-CSF受体的结合活性。 我们注意到，在白血病病态造血时可出现细胞内M-CSF及其受体的高表达，为探讨其作用，采用RT-PCR和ABC免疫酶标技术对12名正常人静脉血标本、21例初诊血液病患者骨髓标本和6株血源细胞系的M-CSF／M-CSF-R mRNA和抗原的表达进行了分析。结果表明正常人外周血单个核细胞未经PHA刺激M-CSF／M-CSF-R均为阴性；经PHA作用20小时后则有强度不等的阳性反应。与正常人不同，血液病患者的造血细胞未经PHA刺激即能测出M-CSF／M-CSF-R的表达。它们的ABC酶标阳性反应物分布于细胞膜、核、质不尽相同。6株细胞系中M-CSF／M-CSF-R呈强阳性反应，且在HL-60细胞中以细胞核阳性反应为主。血液病患者及各细胞系中M-CSF／M-CSF-R的表达与分布呈现出多态性。 人白血病细胞系J6-1呈M-CSF及其受体的高表达，为深入研究M-CSF及其受体在白血病细胞中的作用，以λgt 11做载体，构建了