白细胞介素-6基因的克隆、表达及中试生产工艺的初探

【摘要】：白细胞介素—6在细胞因子网络系统中具有多种生物功能，除具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染等功能外，还对造血系统有着显著的调节作用，特别是对机体血小板的恢复及骨髓造血功能的重建具有一定的临床应用价值。目前国外开发重组人IL-6已进入Ⅱ期临床试验。我国也将IL-6的开发列为重点项目。 IL-6在体内可由多种细胞产生，如外周血单核细胞、成纤维细胞等。其前体由212个氨基酸构成，成熟肽为184个氨基酸，分子量为21KD—28KD，有两个糖基化位点，但糖基化与否并不影响其生物学活性，有4个半胱氨酸构成的2对二硫键对其生物学活性极为重要。 为了能开发出自己的rhIL-6，我们对IL-6进行了基因克隆、表达调控和中试生产的试探性研究。 从PHA诱导的健康人外周血分离的单核细胞中提取总RNA，经RT-PCR方法克隆了人IL-6 cDNA，DNA序列测定发现除第289位碱基是C与文献报导不同外(国外报导该位点为T)，其余顺序与国外报导一致。我们用定点诱变PCR的方法成功地将该位点进行了回复突变，将诱变后的基因插入到pBV220表达载体，并对其SD序列到ATG之间的距离进行了调控研究。将构建的6个含有不同SD序列到ATG之间距离的表达质粒pBV220-IL-6(1—6)转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达，结果表明当SD序列到ATG之间的距离为6bp和10bp时，在SDS-PAGE胶分析上未见表达，而当SD序列到ATG之间的距离为5bp，7bp，8bp，9bp时均可获得高效表达，最高表达量占菌体总蛋白的26％。选择其中的pBV220-IL-6(1)进行发酵表达研究发现，当OD值为1.0—1.5，温度升至42℃，诱导2小时，表达量即可达高峰。表达产物以包涵体的形式存在，在探索和优化了IL-6包涵体的变性、复性条件后，用阴离子交换柱(Q Sepharose HP)一步纯化产品纯度可大于95％，再经Superdex 75pg凝胶柱纯化后纯度达98％，产品经MTT法测定其比活性达1.1×10~8U／mg。本论文成功的探索了重组IL-6的基因克隆、高效表达载体的构建及其表达产物的纯化工作，并对其部分理化性质(包括Western印迹杂交、等电聚焦、N末端)进行了鉴定，为该产品的中试生产打下了良好基础。