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糖尿病基因治疗的实验研究

萧新华  
【摘要】:70余年来,外源胰岛素注射一直是糖尿病治疗的重要措施,不仅Ⅰ型糖尿病依赖外源胰岛素,而且部分Ⅱ型糖尿病亦需要外源胰岛素注射治疗。然由于外源胰岛素注射治疗不能达到正常生理分泌的要求,给患者带来一定痛苦和不便,因此学者们开始从分子水平考虑利用基因工程再造胰岛素分泌的克隆细胞系来替代目前的胰岛素注射治疗和胰岛移植治疗。其主要策略是利用基因重组和转移技术使非胰岛β细胞获得胰岛素合成分泌能力,通过内生胰岛素控制血糖水平。为开展有效的糖尿病体细胞基因治疗新途径,本课题进行了以下工作。 首先,构建了人胰岛素原基因真核表达质粒PRC/CMV.INS。从质粒PBCA中酶切回收260bp的人胰岛素原基因片段,利用中间载体PBS.SK构建了含人胰岛素原基因片段的过渡质粒PBS.INS,在此基础上构建了真核细胞表达的人胰岛素基因重组体PRC/CMV.INS,经核苷酸序列测定证实融合位点正确,重组序列与文献一致,未发现碱基缺失或突变。 继之,利用脂质体法(Lipofectin)将此重组表达质粒转染鼠成纤维细胞(LtK~-),对照用PRC/CMV空载体转染。经G418选择性筛选,重组表达质粒转染细胞筛出表达Neo基因的克隆24株。人胰岛素原表达水平用特异人C肽放免检测结果表示,结果其中8株细胞培养液中C肽可测到含量,从20~98pmol/10~6细胞/24小时不等。从中选出C肽表达量最高的一株细胞(PRI-12)大量培养扩增。


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