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神经营养相关因子基因的克隆、表达及蛋白的纯化研究

马雪梅  
【摘要】:神经营养因子是神经元在胚胎发育期发育或熟和存活所必需的一些分子。由于可能作为一种有效的药物用于治疗各类神经退行性疾病,对它的研究具有重要的理论和应用价值。存在两种类型的神经营养因子:一美为与神经生长因子(NGF)有同源性的神经营养因子,它们构成神经生长因子家族,如NGF,BDNF,NT-3等;另一类为无此同源性的神经营养因子,如GDNF,CNTF等。最近发现IL-6对促进体内损伤神经的再生也有重要作用。 由于这些因子在体内含量甚微,利用基因工程技术进行批量生产,将大大推进基础研究的进程,并为早日进入临床应用奠定基础。 本论文介绍了GDNF、BDNF和IL-6的如下工作。 第一.相关基因的克隆及表达载体的构建。通过PCR的方法分别克隆了GDNF、BDNF和IL-6成熟肽的基因,GDNF、BDNF序列与文献报道相同,IL-6基因与GenBank的序列相比有10个位点发生了突变,但对氨基酸序列没有影响,进一步证明氨基酸序列的保守性对蛋白维持正常功能的重要性。 分别将GDNF、BDNF、IL-6基因连接到E.coli高效表达载体pET30a或pET16。并构建了带有硫氧还蛋白基因(trxA)的表达载体pETR,将GDNF基因与其中的trxA基因相连,构建了表达融合蛋白Thio-GDNF的表达载体。 第二.高效表达基因工程菌株的构建。通过培养条件优化使IL-6、BDNF和GDNF基因在大肠杆菌中均获得高效表达,表达量分别占菌体总蛋白的52.6%、16.3%和16%。Thio-GDNF融合蛋白的表达量则占菌体总蛋白的50.4%,与天然蛋白16%的表达量相比有了大幅度提高,表明我们自己构建的表达载体在高效表达外源基因方面具有较大的优越性。 在工程菌诱导表达过程中,首次发现了二次生长现象,这一发现对进行外源基因的高效表达有重要意义。 第三.表达蛋白的纯化及生物活性测定。以pET16-GDNF的表达为例,用金属螯合亲和层析的方法得到具有较高纯度和活性rhGDNF。用鸡胚背根神经节的测定活性为16-30ng/ml。 在复性过程中,除了用常规GDNF氧化还原系统进行GDNF蛋白的复性,还用自己表达的并初步纯化的硫氧还蛋白进行了尝试,得到了较好的结果。


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