阿片受体信号转导通路新作用机理的初步研究

【摘要】：目的 从基因水平筛选与耐受直接相关的差异片段，从细胞内Ca~(2+)、线粒体膜电势和胞浆pH角度入手初步探讨阿片受体耐受的分子机制。 方法 通过转染、梯度稀释法筛选分别稳定表达μ、κ-阿片受体的HEK293细胞，并用受体结合和细胞内cAMP水平测定的方法对构建的各细胞系进行鉴定。 测定10~(-6)M μ-阿片受体特异性激动剂DAMGO作用μ-CHO 0～120min后细胞内cAMP变化水平。用10~(-6) M DAMGO作用μ-CHO细胞72hr，模拟耐受，通过差异显示PCR、克隆、Northern blot等方法筛选对照组和给药组的差异片段，测序，序列与NIH NCBI BLAST数据库进行同源性比较，分析同源蛋白与耐受的相关性，并从中找寻研究着手点。 用激光共聚焦显微成像技术和流式细胞术观察阿片类药物短时间及长时间作用μ、δ和κ-CHO细胞、μ、κ-HEK293细胞和PC12细胞后细胞内Ca~(2+)、线粒体膜电势和胞浆pH的变化情况，分析三种信号间的相互关系、对细胞脱敏、耐受的影响；分析各亚型受体细胞内Ca~(2+)、线粒体膜电势和胞浆pH影响的异同。 用激光共聚焦显微成像技术和流式细胞术观察10~(-5)M吗啡对PC12细胞凋亡的影响，并分析给药后细胞周期的变化。 结果 1．共筛选得到7个稳定表达μ-阿片受体和3个稳定表达κ-阿片受体的HEK293细胞系。通过受体结合实验测定了细胞膜上受体表达水平，其中，μ10-HEK293细胞的Bmax为0.02308pmol／10~5细胞，与~3H-diprenorphine的解离常数K_d为1.9455nM。κ19-HEK293细胞的Bmax为0.01607pmol／10~5细胞，与~3H-diprenorphine的解离常数K_d为1.080nM。细胞内cAMP水平测定，10~(-9)～10~(-5)M吗啡分别作用μ10-HEK293细胞10min，10~(-10)～10~(-6)M U50,488分别作用κ19-HEK293细胞10min，均可以使细胞内cAMP水平降低，并具有浓度依赖性。 2．10~(-6)M DAMGO作用μ-CHO细胞0～2hr，2min时，DAMGO对AC的抑制作用最为明显，细胞内cAMP浓度只有对照组的5.21％；随后，DAMGO对AC的抑制作用逐渐降低，在10min时，胞内cAMP浓度是对照组的83.93％，20min时已完全恢复至对照组水平；2hr时，细胞内AC处于活化状态，cAMP浓度是对照组的186.15％。 3．DDRT-PCR基因筛选中共得到9条差异片段，同源性比较后，其中3条与已知基因同源性较高。它们分别是大鼠丙酮酸激酶M1和M2亚单位基因(同源性85％)，药物作用后基因水平上调节；人线粒体磷酸基转移蛋白前体基因(dbest比对，同源性92％)，大鼠线粒体H~+／磷酸基同向转运蛋白基因全长(nr比对，同源性92％)，药物作用后基因水平上调；过氧化