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寡核苷酸介导的基因定点纠错及其应用于β-地贫基因治疗的研究

殷文璇  
【摘要】:基因治疗是指将遗传物质导入患者体内,以使患者获得治疗的一种新型治疗方式。要获得理想的临床治疗效果,必须实现靶向性基因治疗。根据基因治疗的原理及过程,其靶向性包括以下三个方面:治疗基因转移的组织特异性、转移基因整合的特异性及转移基因的适宜表达。目前,一些实验室通过改造基因治疗载体结构等基因工程手段获得靶向性治疗已取得进展。基因原位修复策略是一种直接的基因疗法,它针对基因缺陷部位进行修复,保持了基因原有的染色质环境,因此是一种理想的靶向性基因治疗方式。同源重组虽然可以实现缺陷基因的原位替换,而且利用正负筛选的方法可提高ES细胞中同源重组的效率,但同源重组在哺乳动物体细胞中发生的效率极低(10~(-5)-10~(-6)),正负筛选也不适用于体细胞,对于体细胞的基因治疗而言无实际应用的价值。 RNA/DNA嵌合寡核苷酸介导的嵌合体修复术是近年来发展的一项新技术。这项技术的创立是根据RNA可提高同源配对效率的发现,合成出了被称为嵌合体的RNA/DNA杂合寡核苷酸分子,将其导入细胞后,嵌合体可有效地与基因组中同源序列相配对,并在靶位点处形成错配碱基对,体内修复机制能以导入的RNA/DNA寡核苷酸为模板,修改基因组中的同源序列,从而实现基因的定点纠错。嵌合修复的效率比同源重组的效率可高10~3-10~6倍,在细胞及整体动物中都有成功的报道。 最近在应用细胞抽提物系统对嵌合体修复术的机制研究中发现,嵌合体的两条链在定点纠错反应中发挥的作用不同,DNA链具有引发纠错反应的功能,而掺有RNA的嵌合链不具备纠错功能。据此发现一种带有硫代修饰末端的单链DNA的纠错效率比初始设计的嵌合体高3-4倍,若单链DNA寡核苷酸能用于体细胞的定点纠错,则有望获得更高的基因定点纠错的效率,以便应用于由点突变引起的人类遗传性疾病的基因治疗。 为了快速、准确地测定定点纠错事件的发生,以便确定各种打靶分子的定点纠错的功能,我们设计了哺乳动物细胞—定点纠错荧光报告系统。其过程是将定点突变的


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