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毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)基因在链霉菌及大肠杆菌中的克隆表达研究

王朝健  
【摘要】:CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated protein or antige-4,毒性T淋巴细胞相关蛋白-4)是免疫球蛋白超家族成员之一。主要存在于激活的T细胞表面,多以二聚体形式存在,部分以单体形式存在。CTLA-4二聚体与B7具有高亲和力的受体—配基结合活性,结合力较CD28大150倍,是T细胞激活双信号模型中与CD28/B7共同发挥作用的重要的共刺激信号之一,目前被认为是一种天然免疫下调物质。在多种小鼠模型中已经证明阻断CD28/B7分子的共刺激信号,可抑制体液免疫、移植排斥、缓解自身免疫性疾病、阻断多种免疫反应。研究显示CTLA-4胞外片段与转染B7分子的CHO细胞能特异性结合、体外实验表明能与细胞表面B7形成免疫共沉淀、CTLA-4Ig对动物器官移植具有免疫抑制效应,上述结果为该片段用于临床治疗提供了有力证据。 我们通过PCR扩增获得CTLA-4cDNA片段。以含CTLA-4基因的质粒pE为模板,分别设计了能与链霉菌表达质粒及大肠杆菌表达质粒相匹配的引物,采用PCR方法扩增得到相应的CTLA-4片段,序列分析证明结果正确。 在链霉菌中进行了CTLA-4克隆表达研究。本工作应用两种不同信号肽—vsi和gPP对链霉菌的分泌表达进行研究。在vsi信号肽研究中我们构建了两种不同长度的vsi信号肽序列—10bp和230bp与扩增片段的融合,融合片段经列测定证实其阅读框架正确后,克隆入链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒pUWL-219,转化S.lividansTK24。重组菌分别命名为S.lividans[pUWL219-46]和S.lividans[pUWL219-VC]。同时将CTLA-4片段克隆至新型链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒载体pLNSP的gPP信号肽下游。重组菌命名为S.lividans[pLNSP/CTLA-4]. 为考察vsi信号肽及gPP信号肽调控序列对CTLA-4分泌表达的影响,收集不同时间重组菌的发酵上清及菌体进行胞内外分泌研究。SDS-PAGE 及 Western blotting 结果表明:重组菌S.lividans[pLNSP/CTLA-4],和重组菌 S.lividans[pUWL219VC]均能表达


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