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MLC_2-糜酶融合基因克隆、细胞表达及转基因小鼠的产生

何泉  
【摘要】:糜酶是一种丝氨酸蛋白酶,它能高效特异地将血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ。已报道体外实验观察到在人心脏左心室中75%以上的血管紧张素Ⅱ形成酶活性不能被血管紧张素转换酶抑制剂抑制,而能被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制(大部分为糜酶活性),糜酶在人心脏中可能起着重要的作用。而在小鼠心脏中糜酶所形成的血管紧张素Ⅱ不足15%,因此可以选择小鼠作为比较理想的实验动物,建立人心脏糜酶转基因小鼠以便在整体动物体内研究糜酶的结构、功能以及基因表达调控与高血压、心肌肥厚等心血管疾病的关系。 肌球蛋白轻链(myosin light chain-2,MLC2)在心脏中是一种可调控蛋白,通过磷酸化和去磷酸化作用而进行调控。MLC2启动子可通过α-肾上腺素能激动剂诱导使其在心脏组织中特异性过量表达,因此能够有效地调控拼接于MLC2下游的糜酶基因的表达。 一.MLC_2-糜酶融合基因克隆 用BstEⅡ线性化质粒pCHⅠ(含6kb人心脏糜酶基因)DNA,核酸酶BAL31作不同程度双向删切,建立糜酶结构基因系列克隆。通过测序,从97个克隆中筛选出四个合适的糜酶结构基因克隆,以次为P81、P85、P87和P88。以SpeⅠ和KpnⅠ酶解糜酶结构基因克隆质粒DNA,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收3.2kb的糜酶结构基因片段,连入经SpeⅠ和KpnⅠ酶解处理的质粒MLCSVOA(含250bp的大鼠心脏MLC2启动子序列)载体中,建立MLC_2-糜酶融合基因克隆,通过酶解分析,筛选出合适的MLC_2-糜酶融合基因克隆M81、M85、M87和M88用于下一步实验研究。 二.人心脏糜酶基因在分离培养的乳鼠心脏组织细胞中的表达 1.人心脏糜酶基因在培养的Wistar乳鼠心脏组织细胞中的表达:经超速离心纯化的质粒DNA pCHⅠ、pCHⅡ(含11kb人心脏糜酶基因,和pCHⅠ相比,糜酶基因下游多出5kb的序列)和pBS-KS(空载体质粒,作为阴性对照)用改良的磷酸钙共沉淀转化分离培养的Wistar乳鼠心肌细胞和非心肌细胞(包括心内膜细胞,内皮细胞,成纤维细胞以及血管平滑肌细胞等),通过总RNA Dot-blot杂交(以人心脏糜酶基因cDNA作探针)检测人心脏糜酶基因的表达。结果显示,人心脏糜酶基因仅在非心肌细胞中表达,在心肌细胞中不表达,而且人心脏糜酶基因cDNA探针和大鼠心脏糜酶转录产物不产生杂交信号,说明人心脏糜酶基因表达具有强的非心肌细胞特异性。该方面的研究目前还未见文献报


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1 何泉;MLC_2-糜酶融合基因克隆、细胞表达及转基因小鼠的产生[D];中国协和医科大学;1997年
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