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c-myc基因表达的急剧抑制导致人食管癌细胞系的终末分化和凋亡

赵晓航  
【摘要】:c-myc基因在增殖与分化的调控中起着关鍵作用。在增殖旺盛的细胞(无论是正常或是恶性细胞),c-myc的表达均增高。相反,在处于静止期或分化状态的细胞,c-myc的表达很低。c-myc是对有丝分裂刺激因子等的迅速早期反应基因(immediat eraly response gene)。c-myc的产物作用于核内,是一个反式作用的转录因子。研究表明,c-myc基因的异常表达与肿瘤形成密切相关。反义RNA通过同靶mRNA特异性结合而阻断特定基因的功能。因而,以反义c-myc RNA抑制肿瘤细胞中过度表达或扩增的c-myc基因,有可能抑制肿瘤的增殖和恶性表型。 1.本工作构建了含反义人c-myc基因片段的重组逆转录病毒:pDOR-BD9。pDOR-BD9含有部分第一内含子,第二外显子及第二内含子的前8个核苷酸的反义RNA片段。 2.建立了能稳定高效分泌重组逆转录病毒pA-BD9的无性繁殖细胞系pAC-BD9。其培液的病毒滴度达10℃FU/ml。 3.电镜下在pAC-BD9培液中找到了直径为90nm的逆转录病毒颗粒。Southern blot分析证明pAC-BD9含有完整的反义片段。 4.进一步将病毒配液浓缩保存,使含病毒的培液在原滴度基础上浓缩100倍并长期保持活性。 5.在1:1感染强度下。以pA-BD9感染人食管癌细胞系EC8712,经G418筛选后的梭感染细胞表型发生明显改变,细胞生长抑制率为86.3%,不能体外成系。c-Myc蛋白含量降低80%左右,而胎儿和成人食管原代培养细胞的形态和生长速度在用pA-BD9感染后没有明显的改变。 6.在1:10(细胞:病毒)感染强度下,感染后未经G418筛选的EC8712细胞中,有反义RNA片段的整合(Southern blot分析)与表达(Northern blot分析)。内源性c-myc表达水平降低了73.6%。 7.上述1:10感染后细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力明显下降。肉眼下为良性囊肿。显微镜下可见大量中心含有角化珠的巢状结构,周围的细胞核皱缩呈现凋亡样改变。首次观察到反义c-myc RNA特异性地在人食管癌细胞系及其裸鼠移殖物中诱发分化并出现细胞程序性死亡的改变。


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