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Actinobacteria的FISH鉴定方法的建立及分类学的研究

余利岩  
【摘要】:在Bacteria域中有一个分支,包括形态上变化各异的微生物,它们中大多数革兰氏染色呈阳性,被认为是Firmacutes门中的成员。Actinobacteria class nov一般包括具有超过50%G+C的DNA碱基组成的生物。Actinobacteria中的一些种在生物技术和医药方面具有重要的意义。自从链霉素被发现以来,已经从链霉菌和稀有放线菌中得到了大量的抗生素及其它生理活性物质。 考虑到具有一个相近的共同祖先的微生物可能会具有一些共性,同时也考虑到用常规方法,从已进行过深入研究的放线菌中分离到新的有用的次级代谢产物的难度在日益增加,我们扩大了研究对象,从以前的Streptomyces和Streptomyces以外的放线菌扩大到所有的高G+C含量革兰氏阳性细菌。而本论文实验中的Actinobacteria将特指那些具有普通细菌形态的高G+C含量革兰氏阳性细菌。 我们进行了6种Actinobacteria、3种放线菌、1种低G+C含量革兰氏阳性细菌及两种革兰氏阴性细菌对12种抗生素的敏感性实验,并参考日本国北里研究所微生物资源室以往的工作,在分土培养基中,添加了抑制革兰氏阴性菌、低G+C含量革兰氏阳性菌,但对Actinobacteria则几乎没有影响的Nalidixic acid及Aztreonam和抗真菌剂Benlate,使其最终浓度分别为25μg/ml Nalidixic acid、25μg/ml Aztreonam和20μg/ml Benlate。从四份土壤样品中,共分离得到64株细菌。我们用Live Baclight~(TM) Bacteria Gram Stain Kit对分离得到的细菌进行了革兰氏染色特性的研究,得到全部呈红色荧光的革兰氏阳性细菌共计56株,占87.5%,初步结果表明,所选抗生素的加入对抑制革兰氏阴性菌是非常有效的。 我们参考文献,选用和所有细菌都能杂交的或都不能杂交的PU或PN探针以及Amann等设计的以高G+C含量革兰氏阳性细菌为靶点的PHGC探针及PNHGC对照探针进行研究,得到了最适的FISH条件,保证了FISH结果的特异性和敏感性。 为了保证我们初筛的完整性及避免因细菌差异而造成的FISH鉴定结果的误差,我们通过Actinobacteria中21个属的16S rRNA基因的同源性比较设计了两个适用于Actinobacteria的探针PA-1,PA-2,它们分别位于相当于E.coli 16S rRNA的基因228~244及458~485位置上。16S rRNA基因的同源性比较和FISH结果表明,PA-1几乎适用于各种Actinobacteria。而PA-2则只适用于部分的Actinobacteria。考虑到二者在一定程度上起着互补的作用,我们在Actinobacteria初


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