大鼠精子发生中阶段差异表达基因的分离、表达及初步功能研究

【摘要】：精子发生过程中的基因表达具有严格的时间性和空间性，正是这种高度有序的基因表达，使得生精干细胞经过有丝分裂、减数分裂最终分化、发育为成熟的精子。分离、克隆不同发育阶段的差异表达基因，深入研究它们在精子发生中的作用，将有助于阐明精子发生机理。 本研究采用曲细精管分段分离的方法，结合差异显示PCR(DDRT-PCR)技术，筛选精子发生中差异表达的基因。根据不同发育阶段的大鼠生精细胞在曲细精管内规律、有序的排列特点，在透光解剖显微镜下，将曲细精管分为Ⅱ～Ⅵ期、Ⅶ～Ⅷ期、Ⅸ～Ⅻ期及ⅩⅢ～Ⅰ期四段。然后提取四段组织的总RNA并逆转录为cDNA。以3个Oligo-dT12N(N为A、C、G)单锚定引物分别与上游4个随机引物进行12种组合的PCR扩增。经聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影后，筛选出114个具有表达差异性的cDNA条带，再经反向Northern斑点杂交验证，其中有54个cDNA片段在不同区段中存在表达差异。对表达量差异显著的30个cDNA片段进行克隆、测序，得到20个新的具有表达差异的ESTs(Expression Sequence Tags)，登录GenBank，分别获得注册号(AF136164、AF136165、AF136166、AF136168、AF144699、AF144726、AF144727、AF144728、AF144729、AF153477、AF153478、A1690337、A1690338、AW757406、AW757407、AW757408、AW757409、AW757410、AW757411、AW757412)。 选择6个新的ESTs作为混合探针，结合放射性同位素标记法和地高辛标记法标记探针，筛选大鼠睾丸λgt10 cDNA文库，本论文得到三个新的全长cDNA序列。以下分别报告这三个cDNA的序列分析和对其中两个基因的表达分析及初步的功能研究结果。 第一个cDNA全长为1463bp，命名为tSH3p13。它含有一个936bp的开放阅读框，编码一个312个氨基酸的蛋白质，预测分子量为36kD，GenBank登录号为AF227439。经Prosis软件分析，显示该基因编码蛋白属于可溶性蛋白，无跨