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M-CSFR配基结合功能区的克隆与表达

罗寿青  
【摘要】:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)胞外区的,具有全部配基结合活性区域的前三个免疫球样蛋白结构域(D1-3)cDNA[Wang et al,Mol Cell Biol,13:5348-59,1993],经平端连接将其克隆到原核表达载体pET-28a的His-Tag下游,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,D1-3在宿主菌中获得高效表达,表达量约占菌体总蛋白的46%。重组蛋白经Ni~(2+)组氨酸结合树脂螯合层析柱纯化,获得了纯化的D1-3,经SDS-PAGE显示为单一区带,其表观分子量为34kDa。当D1-3终浓度分别为1、0.1及0.01μM时,可以抑制白血病细胞系J6-1的集落形成,具有明显的生物学活性。将D1-3免疫家兔获得了高效价的抗D1-3血清,并纯化得到抗rhM-CSFsR的IgG。用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,EIA)和Scatchard分析证明了D1-3有明显的M-CSF专一结合活性,kd值为7.8nM,只有一个M-CSF结合位点。在此基础上,进一步扩增、克隆并在大肠杆菌中表达了重组蛋白D2-3和D3。D2-3和D3的表观分子量约分别为25、14kD。经Ni~(2+)组氨酸结合树脂螯合层析柱纯化,EIA和Scatchard分析表明,D1-3结合M-CSF的能力是重组D2-3的3倍,前者的kd为11nM,后者的为39nM。而重组的D3则完全没有结合能力。这些数据提示M-CSFR配基结合区的可能模型为:D2-3是配基结合的主体位点,D1为其配基结合的辅助位点,可能对配基结合位点的刚性也有贡献。为了验证该模型,将大肠杆菌中表达的相应功能区DⅢ、DⅡ-Ⅲ、DⅠ-Ⅲ克隆到杆状病毒载体pbluebac4.5中,与杆状病毒DNA一同转导昆虫细胞St9。经过2轮筛选,获得了纯化的重组病毒,再用重组病毒分别感染昆虫细胞,Western blot检测证明DⅡ-Ⅲ和DⅠ-Ⅲ得到了表达,DⅠ-Ⅲ是分泌到上清液中的糖基化蛋白,DⅡ-Ⅲ为滞留于胞浆中的糖蛋白。Western blot分析了不同时间点的DⅠ-Ⅲ、DⅡ-Ⅲ样品,DⅡ-Ⅲ和DⅠ-Ⅲ的表达量在96-120h时达到最大量。将抗D1-3的


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