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应用激光捕获显微切割技术进行人和大鼠不同阶段生精细胞差异表达基因的研究

梁刚  
【摘要】:精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程,是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行,曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合,还可以看到支持细胞、间质细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律。多年来人们采用了重力沉降法、密度梯度离心以及曲细精管分段分离等多种方法试图获得处于不同阶段纯净的各类细胞,但均存在着组织异质性问题。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA文库,就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同精细胞群之间差异表达的基因。 我们利用激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection,LCM)技术,成功地捕获和分离了人和大鼠的初级精母细胞和圆形精子细胞。在此基础上从分离的两种细胞中提取RNA,合成双链cDNA,并进一步通过抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization,SSH)方法构建了人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库、大鼠初级精母细胞(RSA)和圆形精子细胞(RSB)的双向cDNA消减文库。其中所构建人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库的滴度高达5.6×10~7/ml,重组质粒克隆阳性率为88.89,插入片段大小分布主要集中于500bp~750bp。所构建文库的滴度高达8.3×10~9/ml,重组质粒克隆阳性率为91.67%,插入片段大小分布于250bp~1.7kb,主要集中于500bp~1kb。大鼠初级精母细胞(RSA)和圆形精子细胞(RSB)的双向cDNA消减文库的滴度达8.3×10~7/ml,重组质粒克隆阳性率为91.67%,插入片段大小分布于250bp~1.7kb,主要集中于500bp~1kb。 根据SSH的结果,在人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库中选择421个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析,以验证差异表达并分析其表达差异的强度。结果得到390个克隆在两种细胞之间表达差异相差大于2倍。对斑点杂交筛选出的390个克隆进行部分测序,共产生了329个质量满意的ESTs,测序成功率达到84.40%。在大鼠初级精母细胞


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