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应用人自体血清培养人口腔粘膜移植的实验研究尿道下裂修复的形态学研究

刘立强  
【摘要】:尿道下裂是常见的男性泌尿生殖系统先天性畸形,主要表现为远段尿道的缺失,再造尿道是目前的唯一治疗方法,是“以新的手术创伤修复组织缺损”的传统治疗模式,由于组织缺损量较大,且自体组织来源有限,临床应用受到限制,如何以最小的组织损伤完成缺损尿道的修复与再造,组织工程学的出现为此开辟了新的途径。上皮组织是尿道不可缺少的组成部分,因此上皮细胞的培养亦即成为组织工程化尿道的重要内容之一,目前国内外进行的尿道组织工程种子细胞均来源于泌尿系上皮,对供区破坏较大,而且细胞含量相对较少。由于组织学发现口腔粘膜上皮厚度大于皮肤及膀胱粘膜上皮厚度,单位面积内细胞含量较多,因此我们选定口腔粘膜为组织工程化尿道种子细胞来源。 运用组织工程技术建立一个稳定的高成功率的口腔粘膜细胞培养体系,是组织工程粘膜向临床应用的重要前提。我们采用2.4~u/mlDispaseⅡ-0.25%Trypsin联合消化法于不同时间分离口腔粘膜细胞,结果显示:消化5、10、15、30、45分钟时拒染细胞计数为35、59、63、65.5、54(×10~4/ml)及24小时克隆率分别为9.76、7.6、7.13、4.2、2.5(×10~3/cm~2),统计分析及实验结果表明以消化15分钟为最佳时间;不同年龄组口腔粘膜细胞分离数量分别为2.52、2.38(×10~4/mm~2),24小时克隆率分别为7.4、5.2(×10~3/cm~2),两者差别均无显著意义。 为避免异源血清带来的免疫反应和血源传播性疾病,便于组织工程化组织直接应用于临床,我们分别以自体血清、血浆代替胎牛血清为培养基添加成分进行口腔粘膜细胞及上皮组织培养,实验结果示人自体血清、血浆能良好的促进自体口腔粘膜细胞的生长,24小时克隆率、细胞倍增时间及不同接种浓度长满单层所需时间与胎牛血清比较均无显著差异,各组细胞均能良好贴壁、增殖,细胞倍增时间分别为24.02、24.11、20.98小时。对口腔粘膜细胞的继续培养显示,人自体血清与胎牛血清皆能良好促进细胞分化形成完整复层粘膜上皮组织,组织学显示前者优于后者,以20%人自体血清为最佳:血浆组培养粘膜片因有空洞形成而不完整。培养的粘膜上皮组织经0.25%胰酶消化,对获得的细胞以5×10~4/ml接种后细胞迅速增殖形成克隆,7天后长满培养瓶。人口腔粘膜细胞与人脱细胞膀胱粘膜下基质联合培养结果提示人自体血清能良好促粘膜细胞贴附于基质并增殖形成复层。 为进一步鉴定体外培养粘膜上皮在体内存活的状况,分别以国产的快金胶体液和单纯细胞培养液为细胞载体,将含20%人自体血清培养液培养的口腔粘膜细胞移植于裸鼠皮下,3周后抗人-HLA免疫荧光及HE染色证实裸鼠体内能形成完整的人口腔粘膜上皮管腔及上皮组织;将培养的口腔粘膜上皮移植于裸鼠体内,2周后抗人-HLA


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