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中国红豆杉紫杉醇生物合成相关基因的克隆和异源表达研究

涂珺  
【摘要】:紫杉醇属于紫杉烷二萜化合物,在临床上用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症,目前紫杉醇及其半合成原料10-DAB仍然离不开生物来源。现已知有350个以上不同结构的紫杉烷二萜化合物,紫杉烷结构特点表明紫杉醇生物合成过程中从GGDP形成紫杉烷骨架后需要经过一系列的氧合及酰基转移步骤,催化紫杉烷一系列氧合反应和酰基转移反应的酶分别是羟基化酶和酰基转移酶。 为了深入了解紫杉烷的生物合成途径和探讨基因工程技术应用于紫杉醇生产的可能性,采用同源性为基础的PCR方法首次从中国红豆杉cDNA文库克隆得到了一个新的中国红豆杉紫杉烯醇酰基转移酶cDNA序列。它长为1,646 bp,编码区为1,278 bp,推导编码425个氨基酸(GenBank No:AY326950)。根据NCBI-BLASTP比对GenBank序列数据,我们可以推断这个新克隆的cDNA序列编码的酰基转移酶与已鉴定的红豆杉属酰基转移酶属同一亚家族。构建了这个酰基转移酶基因的pET系列原核表达载体,在大肠杆菌中进行了融合表达和非融合表达,探讨了两种表达的差异,初步优化了融合表达条件。采用镍离子亲和层析柱纯化了融合蛋白trxA-TCA,并用多种紫杉烷底物和CoA底物对酶活性鉴定进行了初步探索。 本研究还采用PCR文库筛选方法首次从中国红豆杉cDNA文库中克隆到一个羟基化酶cDNA片段。这个cDNA包含了一个1494bp的开放读码框架,编码497个氨基酸残基(GenBank No:AF545833)。在使用DNAMAN和NCBI-BLASTP进行比对后,推断这个新克隆的TCH1 cDNA序列编码红豆杉紫杉烷10β-羟基化酶。此外,我们从中国红豆杉基因组DNA模板中首次克隆得到TCH1基因组DNA(GenBank No:AY519128)。将TCH1 cDNA片段构建到酵母表达载体pYeDP60上,转化酿酒酵母工程菌WHT进行了非融合表达,得到了相应大小的表达蛋白条带,进行了CO差异显示光谱分析鉴定。另外本研究中首次克隆得到中国红豆杉紫杉烯5α-羟基化酶部分基因序列,为进一步克隆全长基因奠定基础。 本项研究采用了SSP-PCR方法从中国红豆杉cDNA文库中克隆羟基化酶基因。首次克隆得到一个新的中国红豆杉羟基化酶TCH2 cDNA序列。测序表明TCH2


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