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人FL的甲醇酵母表达及腺病毒介导的免疫基因治疗

张艳丽  
【摘要】:人FL(flt3 ligand)是近年发现的重要造血细胞因子,其功能类似于hSCF,主要作用于早期原始的干/祖细胞,促进其增殖和分化,与其它细胞因子联合应用,可产生明显的协同作用。与hSCF不同的是,hFL对肥大细胞没有作用,没有种属特异性,并且可显著刺激树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)的增殖。这些功能使FL在造血系统原发性或继发性损伤疾病的治疗、造血干细胞移植,特别是在肿瘤免疫基因治疗和免疫疫苗制备等方面具有重要的潜在应用价值。DCs细胞作为功能最强的抗原提呈细胞(APC),在免疫应答反应中起着关键作用,能诱导非特异性先天免疫反应和特异性获得免疫反应。利用FL扩增DCs的抗肿瘤免疫治疗效果,在动物模型中已得到验证。本研究利用hFL能显著刺激体内DCs增殖的生物学特性,用基因工程方法表达重组hFL,对小鼠种植瘤进行抑瘤效果试验,为进一步研究hFL在肿瘤免疫治疗中的有效作用提供实验依据。本论文主要包括两部分内容: 一、应用酵母表达系统,表达分泌性人FL(hFL)的K84E/Q122R突变体。hFL第84位和122位氨基酸的密码子分别改造为E和R的密码子,并在N端采用甲醇酵母偏爱密码子,以提高hFL的活性和表达量。将该突变体的基因克隆入酵母穿梭质粒,得到重组表达载体pPIC9K-hFL,电转入甲醇酵母,用原位双膜筛选法筛选获得Mut~+及Mut~s高表达转化子,分别进行了表达条件的优选并基本建立了分离纯化rhFL的工艺,两者最佳表达条件为:Mut~+转化子用BMMY培养基(pH6.0),Mut~s转化子用BMM(pH6.0),经2%甲醇诱导96h。与Mut~+型相比,Mut~s转化子在含营养和色素较少的BMM培养基中即有高表达,且表达产物杂蛋白少,易于纯化。重组hFL表达量达30mg/L。采用Q-FF分离→浓缩→Sephacryl S-200分离纯化,步骤简单有效。回收率约为20mg/L。用内糖苷酶EndoH切除hFL N-糖链后,结果显示hFL中除N-糖基化外,可能还有其他形式的糖基化。纯化的hFL经Western印迹和N端前10个氨基酸序列分析验证,结果与预期一致,质谱法测定其分子量为20~22kD。 生物学活性实验结果表明,单用hFL可以显著刺激小鼠骨髓有核细胞扩增,与mGM-CSF联用可以协同增强刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。 rhFL对鼠EL4淋巴瘤的抗肿瘤结果表明:小鼠皮下移植EL4淋巴瘤,连续注射14天hFL后,肿瘤比对照组减小,抑瘤率为25%左右。P<0.001,差别具有显著统计学意义。


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