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血糖调节相关基因的功能分析

李云峰  
【摘要】:通过mRNA差异显示本组已经从高血糖刺激的SD大鼠骨骼肌中克隆到一系列与血糖调节相关基因,其中一个基因被命名为Fang1(GenBank收录号为AF399873),经BLAST分析已获得的Fang1基因,它同人的泛酸激酶(pantothenate Kinase 4,PANK4)具有很高的同源性(GenBank收录号为AK001644),二者核苷酸序列同源性达86%,氨基酸序列同源性达到92%,因此我们可以确定Fang1就是大鼠泛酸激酶基因(rat PANK4)。从NCBI分析结果看,PANK4基因从小鼠到人都很保守。分析PANK4的结构域发现,在PANK4蛋白中含有两个保守的结构域,分别为:KOG2201,其同源结构域fumble与细胞分裂有关;KOG4582,其同源结构域DUF89,存在于原核蛋白pfam01937内,但功能未知。 用PANK4基因与绿色荧光蛋白融合表达的质粒转入L-6TG,HEK293T和HeLa细胞中,发现PANK4表达于细胞质中。用免疫兔子获得的PANK4抗体对SD大鼠的骨骼肌、心肌、肺、肝脏、肾脏、胰腺、甲状腺、大脑、小肠和脾脏进行免疫组化检测,发现PANK4多表达于需要较高能量或合成旺盛的细胞中。通过酵母双杂交实验,发现PANK4与SD大鼠的丙酮酸激酶(Pkm2)相互作用,二者的相互作用进一步通过pull-down和免疫共沉淀实验得以验证。在HEK293T和Hela细胞中的细胞免疫荧光实验分析EGFP-PANK4和带FLAG标签的Pkm2瞬间表达,激光共聚焦显微镜观察结果表明,二者共表达于细胞质中。同时,两个结构域(KOG2201和KOG4584)分别与Pkm2进行免疫共沉淀实验后发现,两个结构域都可以与Pkm2蛋白结合,它为确定KOG4584结构域的功能提供了思路,提示KOG4584结构域可能是Pkm2的一个重要调节因子。PANK4可以直接与Pkm2基因相互作用,说明PANK4可以直接参与血糖代谢,它可能是通过调节Pkm2的活性来调节糖代谢的。 Pkm2是糖酵解途径的关键酶之一,它在细胞内有低活性的二体形式和高活性的四体形式,高浓度的葡萄糖可以促进Pkm2的二体迅速转变成为高活性的四体形式,从而促进Pkm2的活性。从Pkm2的活性实验可以看出,PANK4的表达促进Pkm2的活性,同时KOG2201结构域也可以很大程度提高Pkm2的活性,我们推测两个结构域可能分别与两个二体的Pkm2作用,然后促进Pkm2形成高活性的四体。 根据本组在人PANK4基因上发现的与2型糖尿病相关的SNP位点,我们克隆了人PANK4基因,并引进了位于Exon13的阳性SNP位点。为研究该SNP位点对于PANK4的功能的影响奠定了基础。


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