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SARS冠状病毒PUMC02株全基因组cDNA的分段克隆及N蛋白的功能研究

樊峥  
【摘要】:SARS病毒是一种新型的冠状病毒,可以引起人类急性传染性疾病——严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)。它是一种正链RNA病毒,基因组RNA全长29.7kb,5’端三分之二的部分编码病毒的复制酶(replicase),复制酶经蛋白酶水解后,裂解为多个非结构蛋白,包括蛋白水解酶3CL~(PRO)(nsp2),RNA聚合酶RdRp(nsp9),解旋酶Hel/NTPase(nsp10)和甲基转移酶MTase(nsp13)等;基因组3’端三分之一的部分编码病毒的主要结构蛋白质,S蛋白,E蛋白,M蛋白和N蛋白。这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。 对SARS冠状病毒基因组的全面了解和重要蛋白的功能研究将有利于揭示该病毒的致病机理,为寻找有效的治疗药物,彻底战胜这场疾病奠定基础。因此,本论文分为两部分,第一部分获得了覆盖SARS冠状病毒PUMC02株全基因组的cDNA分段克隆,第二部分对重要的结构蛋白—N蛋白的功能进行了初步的研究。 论文的第一部分,根据NCBI已公布的SARS冠状病毒的基因组序列,结合多个毒株基因组的限制性内切酶酶谱分析,设计了12对引物,将SARS冠状病毒基因组全长分为12个3kb左右的片段,以SARS病毒PUMC02株感染的非洲绿猴肾细胞Vero E6细胞的总RNA作为模板,用RT—PCR扩增得到了12个eDNA片段,经序列测定,这12个cDNA片段覆盖了SARS冠状病毒PUBIC02株的全基因组,为构建SARS冠状病毒的全长cDNA克隆提供了条件。与其它10株SARS冠状病毒分离株的全基因组序列进行进化分析,结果显示PUMC02株可能来源于SARS的发源地广东。同时,经RT-PCR扩增得到了几个具有重要功能的SARS冠状病毒的结构蛋白和非结构蛋白的基因,并对蛋白水解酶3CL~(PRO),甲基转移酶MTase(nsp13)进行了原核表达和纯化,为这些蛋白的结构和功能研究奠定了基础。 第二部分为SARS冠状病毒N蛋白的功能研究。已知的许多RNA病毒的N蛋白是一个多功能的蛋白质,在病毒的生活周期中具有重要的作用。对SARS冠状病毒的N蛋白的生物信息学分析发现,它是一个碱性蛋白质,等电点为10.11,理论分子量为46 kDa,存在多个可能的磷酸化位点。在C末端结构域有一段富含赖氨酸的序列,属于典型的细胞核定位信号。在中间结构域,有一段SR富集区,推测可能与RNA的结


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