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利用转基因小鼠研究启动子突变HPFH及Yunnanese(Aγδβ)~0-地贫中γ-珠蛋白基因再活化的机制

刘立仁  
【摘要】:珠蛋白基因作为具有组织和发育阶段特异性的基因家族,一直是真核基因表达调控研究的模型。人β-珠蛋白基因簇包含五个功能基因,按5′-ε-Gγ-Aγ-δ-β-3′顺序排列。在个体发育过程中,这些基因的表达经历两个开关,即发生在妊娠早期的由胚胎(ε)向胎儿(Gγ和Aγ)以及发生在围产期的由胎儿向成人(δ和β)的开关。人γ-珠蛋白基因主要在胎肝红细胞中表达,在成人骨髓红细胞中γ-珠蛋白不足β-类珠蛋白总量的1%。然而,天然发生的β-珠蛋白基因簇内的缺失突变或γ-珠蛋白基因启动子点突变可能影响胎儿到成人的开关,导致γ-珠蛋白基因在成人期持续活跃表达。这种情况包括遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征(Hereditary PersistenceofFetal Hemoglobin,HPFH)以及(δβ)~0-地中海贫血两类。这些天然突变体为血红蛋白开关机制的研究提供了很好的模型。此外,胎儿血红蛋白(HbF,α_2γ_2)在成人期表达的增加,能够减轻β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血的临床症状。因此,对这些天然突变体中γ-珠蛋白基因再活化机制的研究不仅有助于揭示血红蛋白开关机制,而且可能为发展β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血的基因治疗提供线索。 近年来,随着转基因动物制备技术的日趋成熟与完善,建立转基因动物模型已经成为研究真核基因表达调控的一种重要手段。利用转基因技术研究真核基因的表达,既可以在分子水平上设计实验,又能包括基因表达的诸多影响因素,从而能够进一步深入探讨基因的表达调控规律。 本文首先构建了重组粘粒μLCRAγψδβ。该重组粘粒包含由基因座控制区(LCR)中HS1~4核心顺序组成的3.1kb μLCR以及29kb具有天然染色体排列顺序的人Aγ-、δ-和β-珠蛋白基因及其下游序列。此片段能够较好地模拟机体天然染色体微环境,克服小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷,从而能够比较客观地揭示珠蛋白基因簇的表达调控规律。在大量制备重组粘粒DNA后,我们用氯化钠密度梯度离心法分


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