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小鼠精子发生不同阶段生精细胞基因表达谱的研究

俞作仁  
【摘要】:精子发生是一个特殊的细胞分化过程,双倍体的精原细胞经过两次减数分裂形成单倍体的圆形精子细胞,后者再经过精-组蛋白转换、核浓缩、细胞变态等过程最终形成长形精子。精子发生的分子机制尚处于探索阶段,越来越多的精子发生相关基因被发现,但还未见调控精子发生关键基因的报道。我们利用新近发展的生物技术,比如荧光差异显示,DNA微阵列等,研究不同生精细胞中众多基因的表达特征,从中寻找一批在精子发生不同阶段差异表达的基因,根据其有关功能及表达规律试图获得一些精子发生的基因调控信息或规律,或找到调控精子发生的关键基因,从而进一步深入研究精子发生的分子机理。本研究主要包括三个部分的内容。 一:各期生精细胞的分离。我们以2%-4%连续梯度为分离介质,采用重力沉降法结合贴壁培养的方法分离纯化各期生精细胞。从6日,9日,2周,3周,5周及8周龄的Balb/c小鼠睾丸中分别获得原始A型精原细胞,B型精原细胞,前细线期初级精母细胞,粗线期初级精母细胞,圆形精子细胞及长形精子细胞,细胞纯度分别达到94%,90%,88%,95%,96%及92%。采用离心的方法从12周龄小鼠附睾中获得成熟精子,纯度98%。 二:利用改进的DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST。我们以小鼠的原始A型精原细胞及B型精原细胞为研究对象,以荧光差异显示方法筛选差异表达基因。利用斑点杂交技术对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。选取16条表达差异显著的片段做克隆测序,通过GenBank/Blast比较,有7个片段属于新的EST,且均表现为在B型精原细胞中表达强度高于原始A型精原细胞。提交GenBank获得注册号。从中选取较有意义的3条基因片段通过半定量RT-PCR方法进一步验证其表达特征。和传统的差异显示方法比较,文中所采用的改良mRNA差异显示技术可快速排除假阳性结果;避免同位素标记带来的放射性污染。结果表明所获得的7条新EST均表现为在B型精原细胞中表达上调,我们推


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