收藏本站
收藏 | 论文排版

细菌人工染色体(BAC)介导的突变人α-珠蛋白基因簇转基因小鼠的研究

唐晓彬  
【摘要】: 人类珠蛋白基因家族分为α和β两个基因簇。位于第11号染色体短臂上的β-珠蛋白基因簇以5’-ε-Gγ-Aγ-Ψβ-δ-β-3’顺序排列;位于第16号染色体短臂上的α-珠蛋白基因簇以5’-ζ-Ψζ-Ψα_2-Ψα_1-α_2-α_1-θ-3’顺序排列,全长约40kb,其中ζ为胚胎型功能基因,α为胎儿型和成年型功能基因,θ珠蛋白基因也是成年型基因,表达量很低,功能未知。随着个体发育,人类α,β-珠蛋白基因簇按照其在染色体上的排列顺序由5’到3’端依次表达,两类基因的表达具有高度的组织特异性和发育阶段特异性,且其终产物始终维持平衡。 珠蛋白基因的表达受到转录前的表观遗传信息、转录水平、转录后水平、和翻译水平的调控,形成一个复杂而精密的调控网络。珠蛋白基因的转录受多种因素的影响,其调控主要通过结构基因近端和远端的顺式作用元件,红系特异的和普遍存在的反式作用因子发挥作用。其中α-珠蛋白基因簇的主要增强子HS-40位于ζ-珠蛋白基因的上游大约40kb的位置,细胞水平和小片段转基因动物研究证明HS-40对于簇内各个珠蛋白基因在红系组织细胞中的高表达是必需的,而在HS-40和ζ-珠蛋白之间的多个DNaseⅠ高敏位点(HS-33、HS-10、HS-8和HS-4)则被证明与人α-珠蛋白的表达无关。但最近发现将小鼠α-珠蛋白基因簇上游结构与功能等同于人HS-40的HS-26敲除后,血红蛋白水平没有降低,只呈现很温和的α-地贫表型;而且至今没有天然缺失HS-40从而导致α-地贫的病例。说明包括HS-40在内的几个高敏位点的确切功能及作用模式仍有待进一步探讨。 转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组中稳定整合并能遗传给后代的一类动物。利用转基因动物可以在分子水平设计实验,从四维时空观察转基因的整体效应。利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型,以探讨异常基因的表达调控规律。大容量载体技术可以模拟机体天然染色质微环境,克服小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷,从而研究大片段基因簇的表达调控规律。近年发展起来的建立在大肠杆菌F因子基础上的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)遗传特性稳定,不易发生缺失和重组;制备和纯化方法简便快速;可直接进行DNA测序分析;载体上的稀有限制性内切酶NotI位点可以方便地线性化BAC DNA并去除载体片段。 本实验室已从人基因组BAC文库中成功筛选到包含完整的人α-珠蛋白基因簇的BAC克隆-BAC 191K2,并利用温度敏感型的穿梭载体(shuttle vector)介导经同源重组修饰BAC DNA的方法删除了人α-类珠蛋白基因簇中HS-40的核心序列获得BAC突变体αMⅠ。 在此基础上,为了定义α-珠蛋白基因簇上游各调控元件的调控功能,并探讨其作用机制,本研究利用缺陷型原噬菌体介导的同源重组法修饰α-BAC,删除包括HS-33、HS-10、HS-8和HS-4在内长达31.7kb的序列得到BAC突变体αMⅡ;又利用温度敏感型的穿梭载体介导的同源重组法删除包括HS-40、HS-33、HS-10、HS-8和HS-4在内达35.4kb的序列,得到BAC突变体αMⅢ。大量提取并纯化αMⅠ、αMⅡ和αMⅢ这三个删除不同上游调控元件的突变体BAC DNA,用NotI酶切分离出完整的插入片段,经Sepharose CL-4B柱凝胶过滤层析快速分离插入DNA片段和载体DNA,选择合适浓度的DNA进行显微注射制备转基因小鼠。经PCR和Southern Blot鉴定出完整整合的阳性转基因鼠后,收集不同发育阶段的组织提取RNA,用核酸酶保护实验(RNaseProtection Assay,RPA)检测人α-类珠蛋白基因表达情况。结果表明:1)得到6株完整整合的αMⅠ转基因鼠株系,RPA分析显示删除HS-40后,人ζ-和α-珠蛋白基因单拷贝表达水平都比正常转基因鼠的表达水平低,但仍可维持较低水平的表达。人α-类珠蛋白基因呈现整合位点依赖性而拷贝数非依赖性的表达,组织表达特异性与发育阶段特异性表达模式正确;2)得到5株完整整合的αMⅡ转基因鼠株系,RPA结果显示HS-4~33的删除对两个发育阶段的人α-类珠蛋白基因表达影响不同:人ζ-珠蛋白基因单拷贝表达水平与正常转基因小鼠相比无明显差异,没有降低。人α-珠蛋白基因单拷贝表达水平较正常转基因鼠的表达水平低。人α-类珠蛋白基因呈现整合位点依赖性而拷贝数非依赖性的表达,且组织表达特异性与发育阶段特异性表达模式正确;3)得到7株完整整合的αMⅢ转基因鼠株系,在删除HS-4~40后,人α-类珠蛋白基因在各个发育阶段,红系及非红系不同组织均无表达;4)人α-类珠蛋白基因在转基因鼠中的表达不干扰内源α-类珠蛋白基因的表达水平。 综上结果说明:1)即便是对于含高度重复序列的人α-珠蛋白基因簇,选取适当的同源重组方法也可将其成功修饰,从而得到正确的突变体;2)人α-类珠蛋白基因在转基因鼠中的表达并不干扰内源珠蛋白基因的表达水平,因而以相应时期的鼠内源α-类珠蛋白基因作对照定义人α-类珠蛋白基因的表达水平可保证准确性;3)HS-40以及HS-4~33删除后,人α-类珠蛋白基因仍呈现正确的组织特异性和发育阶段特异性表达,说明人α-类珠蛋白基因正确表达模式的维持至少不依赖于某单一上游调控元件;4) HS-4~40的删除造成人α-类珠蛋白基因的沉默,说明该段序列对于人α-珠蛋白基因簇在转录水平上的正常表达至关重要;5)HS-40核心序列的缺失显著降低了人α-类珠蛋白基因的表达水平,说明HS-40对于人α-类珠蛋白基因在转录水平上的表达具有重要作用,但并非是维持人α-类珠蛋白基因转录表达的唯一元件;6) HS-4~33的大片段DNA序列缺失使人α-珠蛋白基因转录水平上的表达明显下降,但是人ζ-珠蛋白基因仍维持较高的转录水平。说明在这段序列中,存在具有发育阶段特异性的调控作用的元件。 我们的研究结果最终表明,HS-4~33和HS-40对于人α-类珠蛋白基因表达的调控均是有意义的,但又都不足以单独指导人α-珠蛋白基因簇的表达。我们推测:类似于β-珠蛋白基因簇远距离调控元件LCR的成环作用机制,人α-珠蛋白基因簇的上游调控元件HS-4~40也是以成环机制作用于结构基因的启动子,从而完成对人α-类珠蛋白基因在转录水平上的调控,而HS-40和HS-4~33在调控过程中的作用又有不同:HS-40对每个时期的人α-类珠蛋白基因都有重要的增强作用;而HS-4~33则呈现了发育阶段特异性的增强作用,只对胎儿/成年型人α-珠蛋白基因有调控作用,而对胚胎型人ζ-珠蛋白基因没有增强作用,只在HS-40缺失时才会援救其表达。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 史瀛仙;;超级鼠和超级鱼——介绍转基因动物[J];生物学通报;1989年10期
2 张鑫;尹逊河;苗向阳;曲朝杰;张秋婷;马艳芳;;抗菌肽Thanatin转基因小鼠建立的初步研究[J];中国兽医学报;2010年03期
3 程萱;卢一凡;邓继先;周江;;获得高质量受精卵进行转基因[J];生物技术通报;1997年06期
4 严华,李国才,孙怀昌;转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立[J];中华医学遗传学杂志;2005年05期
5 周国岭;宋崴;付湘辉;辛立;唐晓彬;冯冬晓;刘光;刘德培;;转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化[J];中国医学科学院学报;2007年03期
6 孙明增,琦祖和;人突变appE基因在转基因鼠体内的表达及血清脂质变化[J];中国生物化学与分子生物学报;1998年03期
7 李宝林,史元元;乳腺特异性表达172~(HIS)突变型p53转基因鼠的建立[J];发育与生殖生物学报(英文版);1996年02期
8 朱孝荣;袁红花;袁凤刚;高殿帅;孙怀昌;;脑组织特异表达钙结合蛋白D-28k转基因小鼠的制备[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2009年04期
9 贾俊双;肖高芳;林晓琳;张晟;姚志芳;杜文婷;申红芬;刘科;饶子亮;孙妍;姚开泰;肖东;;慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠[J];中国比较医学杂志;2010年02期
10 严志江,钱若兰;人体β-类珠蛋白基因时空表达与调控[J];细胞生物学杂志;1994年04期
11 黄玉政;成勇;柏亚军;冯亚杰;;人乳铁蛋白转基因小鼠杂交选育的研究[J];动物医学进展;2007年06期
12 李新云;王趁芳;任红艳;赵书红;杨述林;崔文涛;牟玉莲;李奎;;跨膜蛋白66生物信息学分析及其突变体转基因小鼠构建[J];畜牧兽医学报;2010年01期
13 夏芸,钱若兰;红系KLF因子研究进展[J];细胞生物学杂志;2004年02期
14 杜丽;孟庆文;满处日嘎;王凤阳;;转基因表达的时空调控[J];动物医学进展;2010年10期
15 谢俊;许淼;龚秀丽;曲立娟;颜景斌;黄英;;优化反向PCR法对hTF转基因小鼠整合位点旁侧序列分析[J];中国医药生物技术;2011年03期
16 韩文灿;张禄卿;王博;徐朗莱;;血管内皮生长因子C嵌合体(CA65)转基因小鼠的建立和分析[J];南京大学学报(自然科学版);2011年04期
17 Westphal H ,章静波;转基因哺乳动物和生物工艺学[J];国际遗传学杂志;1990年03期
18 徐学明,傅敏庄,王葆春,朱定尔;急性粒细胞白血病珠蛋白基因表达失衡的研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1996年06期
19 卢一凡,邓继先,程萱,黄培堂;RT-PCR测定组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)在转基因鼠乳腺表达的研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年03期
20 周厚清,薛越强,杨鹏,李卓成,琦祖和;cDNA微阵列分析人apoE_4转基因鼠肾脏基因表达谱的变化[J];中国实验动物学报;2005年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 何迎春;田道法;田甜;;外源p53mt和LMP1基因在转基因小鼠组织中的表达分析[A];全国中西医结合耳鼻咽喉科学术会议论文汇编[C];2005年
2 颜景斌;肖艳萍;陈美珏;王舒;任兆瑞;曾溢滔;;红系特异元件调控的GFP报道基因在不同转基因小鼠中表达行为的研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
3 田金洲;时晶;张雷明;尹军祥;盛树力;任映;王蓬文;王蓉;;金思维提取物预防Aβ42淀粉样蛋白产生及其机制研究[A];中医药优秀论文选(下)[C];2009年
4 颜景斌;王舒;肖艳萍;贾春平;;人-珠蛋白位点控制区HS-2、HS-3元件指导的绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠家系中的表达研究[A];第六次全国医学遗传学学术会议文摘汇编[C];2005年
5 徐骏;张志愿;陈万涛;杨文君;王铸钢;王龙;王延安;;转基因小鼠血管瘤动物模型建立[A];2004年口腔颌面肿瘤基础研究学术研讨会会议日程及论文集[C];2004年
6 李伟;谢书阳;任兆瑞;曾溢滔;曾凡一;黄淑帧;;利用慢病毒介导制备转β珠蛋白基因小鼠评价β地中海贫血的基因治疗[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年
7 高慧;王琴;成蓓;朱晓芳;冯永山;;HPV16E6/7转基因小鼠成瘤情况观察[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年
8 陈辉;金辉;张钦宪;高翔;郑红;李晓文;;SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立及生物学特性研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
9 童佳;郑敏;王美丽;李宁;;猪生长激素在转基因小鼠体内中的表达研究[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
10 董婉维;郑志红;;小鼠睾丸特异基因Fank1基因敲减转基因小鼠模型的建立[A];第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)论文摘要汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 唐晓彬;细菌人工染色体(BAC)介导的突变人α-珠蛋白基因簇转基因小鼠的研究[D];中国协和医科大学;2006年
2 冯东晓;细菌人工染色体(BAC)介导的人α-珠蛋白基因簇转基因小鼠的研究[D];中国协和医科大学;2001年
3 李政;酵母人工染色体(YAC)介导的含HS2定点突变的人β-珠蛋白基因簇在转基因小鼠中的表达[D];中国协和医科大学;1998年
4 刘庆辉;带红系增强子的人βE-珠蛋白基因在转基因小鼠中的表达[D];中国协和医科大学;1992年
5 黄粤;含人β-珠蛋白基因簇的细菌人工染色体(BAC)介导的转基因鼠研究[D];中国协和医科大学;2000年
6 沈伟;用BAC介导的转基因鼠研究人α与β珠蛋白基因簇的表达调控[D];中国协和医科大学;2005年
7 韦玉生;BAC介导ApoCⅢ增强子删除的人载脂蛋白apoAⅠ/CⅢ/AⅣ/AⅤ基因簇突变株转基因鼠系的建立以及其与完整基因簇转基因小鼠的比较研究[D];中国协和医科大学;2005年
8 高俊;细菌人工染色体(BAC)介导的人载脂蛋白apoA-Ⅰ C-Ⅲ A-Ⅳ A-Ⅴ基因簇转基因小鼠研究[D];中国协和医科大学;2002年
9 孙明增;用转基因鼠模型研究突变apoE基因表达的整体水平效应[D];中国协和医科大学;1998年
10 傅湘辉;珠蛋白基因开关的组蛋白密码以及转基因鼠中外源基因定位的研究[D];中国协和医科大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋东东;人Man2cl基因表达对移植性肿瘤在小鼠的生长及小鼠体液性免疫应答的影响[D];中国协和医科大学;2006年
2 张玉峰;增强子对提高山羊β-酪蛋白调控序列指导人乳铁蛋白基因在转基因动物乳腺中特异性表达水平的研究[D];扬州大学;2006年
3 缪明星;不同乳蛋白调控区指导hLF基因在转基因小鼠中表达水平的研究[D];扬州大学;2009年
4 张南;乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠病毒蛋白表达模式的研究[D];第二军医大学;2006年
5 钱波;心肌特异性高表达热休克蛋白27诱导小鼠心肌肥厚[D];南京医科大学;2007年
6 郑逸梅;pBC-rtTA转基因小鼠模型的建立和应用[D];扬州大学;2006年
7 杜静;PDGF-CCK转基因小鼠的建立及CCK对摄食行为影响的初步研究[D];中国协和医科大学;2007年
8 黄正芳;HPV16 E_(6/7)转基因动物模型的建立[D];扬州大学;2005年
9 方亮;PTA1/CD226转基因小鼠胸腺细胞的发育研究[D];第四军医大学;2006年
10 沈萍;对人类巨细胞病毒极早期基因启动子(HCMV MIEP)的转录调控机制研究及其应用[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 田红 记者 胥茜;论文无创新 一票能否决[N];中国教育报;2005年
2 王握文周珞晶 吴丹;11篇全国优秀博士学位论文的启示[N];科技日报;2008年
3 记者 欧阳春艳;全国百篇优秀博士学位论文评选揭晓[N];长江日报;2005年
4 ;我国学者成功建立一套转基因小鼠系统[N];中国医药报;2002年
5 本报特约通讯员  汤宏;播撒创新的种子[N];解放军报;2006年
6 学位办;研究生院奖励优秀博士学位论文[N];中国社会科学院院报;2008年
7 徐宜军;哈工大博士学位论文实行匿名评议制度[N];新华每日电讯;2005年
8 周玲玲;2007年全国优秀博士学位论文评选结果公布[N];中国教育报;2007年
9 王曼;充分利用院图书馆特色文献信息资源[N];中国社会科学院院报;2005年
10 李大庆;中科院为今年留院博士启动研究工作[N];科技日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978