细菌人工染色体（BAC）介导的突变人α-珠蛋白基因簇转基因小鼠的研究

【摘要】： 人类珠蛋白基因家族分为α和β两个基因簇。位于第11号染色体短臂上的β-珠蛋白基因簇以5’-ε-Gγ-Aγ-Ψβ-δ-β-3’顺序排列；位于第16号染色体短臂上的α-珠蛋白基因簇以5’-ζ-Ψζ-Ψα_2-Ψα_1-α_2-α_1-θ-3’顺序排列，全长约40kb，其中ζ为胚胎型功能基因，α为胎儿型和成年型功能基因，θ珠蛋白基因也是成年型基因，表达量很低，功能未知。随着个体发育，人类α，β-珠蛋白基因簇按照其在染色体上的排列顺序由5’到3’端依次表达，两类基因的表达具有高度的组织特异性和发育阶段特异性，且其终产物始终维持平衡。 珠蛋白基因的表达受到转录前的表观遗传信息、转录水平、转录后水平、和翻译水平的调控，形成一个复杂而精密的调控网络。珠蛋白基因的转录受多种因素的影响，其调控主要通过结构基因近端和远端的顺式作用元件，红系特异的和普遍存在的反式作用因子发挥作用。其中α-珠蛋白基因簇的主要增强子HS-40位于ζ-珠蛋白基因的上游大约40kb的位置，细胞水平和小片段转基因动物研究证明HS-40对于簇内各个珠蛋白基因在红系组织细胞中的高表达是必需的，而在HS-40和ζ-珠蛋白之间的多个DNaseⅠ高敏位点(HS-33、HS-10、HS-8和HS-4)则被证明与人α-珠蛋白的表达无关。但最近发现将小鼠α-珠蛋白基因簇上游结构与功能等同于人HS-40的HS-26敲除后，血红蛋白水平没有降低，只呈现很温和的α-地贫表型；而且至今没有天然缺失HS-40从而导致α-地贫的病例。说明包括HS-40在内的几个高敏位点的确切功能及作用模式仍有待进一步探讨。 转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组中稳定整合并能遗传给后代的一类动物。利用转基因动物可以在分子水平设计实验，从四维时空观察转基因的整体效应。利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型，以探讨异常基因的表达调控规律。大容量载体技术可以模拟机体天然染色质微环境，克服小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷，从而研究大片段基因簇的表达调控规律。近年发展起来的建立在大肠杆菌F因子基础上的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)遗传特性稳定，不易发生缺失和重组；制备和纯化方法简便快速；可直接进行DNA测序分析；载体上的稀有限制性内切酶NotI位点可以方便地线性化BAC DNA并去除载体片段。 本实验室已从人基因组BAC文库中成功筛选到包含完整的人α-珠蛋白基因簇的BAC克隆-BAC 191K2，并利用温度敏感型的穿梭载体(shuttle vector)介导经同源重组修饰BAC DNA的方法删除了人α-类珠蛋白基因簇中HS-40的核心序列获得BAC突变体αMⅠ。 在此基础上，为了定义α-珠蛋白基因簇上游各调控元件的调控功能，并探讨其作用机制，本研究利用缺陷型原噬菌体介导的同源重组法修饰α-BAC，删除包括HS-33、HS-10、HS-8和HS-4在内长达31.7kb的序列得到BAC突变体αMⅡ；又利用温度敏感型的穿梭载体介导的同源重组法删除包括HS-40、HS-33、HS-10、HS-8和HS-4在内达35.4kb的序列，得到BAC突变体αMⅢ。大量提取并纯化αMⅠ、αMⅡ和αMⅢ这三个删除不同上游调控元件的突变体BAC DNA，用NotI酶切分离出完整的插入片段，经Sepharose CL-4B柱凝胶过滤层析快速分离插入DNA片段和载体DNA，选择合适浓度的DNA进行显微注射制备转基因小鼠。经PCR和Southern Blot鉴定出完整整合的阳性转基因鼠后，收集不同发育阶段的组织提取RNA，用核酸酶保护实验(RNaseProtection Assay，RPA)检测人α-类珠蛋白基因表达情况。结果表明：1)得到6株完整整合的αMⅠ转基因鼠株系，RPA分析显示删除HS-40后，人ζ-和α-珠蛋白基因单拷贝表达水平都比正常转基因鼠的表达水平低，但仍可维持较低水平的表达。人α-类珠蛋白基因呈现整合位点依赖性而拷贝数非依赖性的表达，组织表达特异性与发育阶段特异性表达模式正确；2)得到5株完整整合的αMⅡ转基因鼠株系，RPA结果显示HS-4～33的删除对两个发育阶段的人α-类珠蛋白基因表达影响不同：人ζ-珠蛋白基因单拷贝表达水平与正常转基因小鼠相比无明显差异，没有降低。人α-珠蛋白基因单拷贝表达水平较正常转基因鼠的表达水平低。人α-类珠蛋白基因呈现整合位点依赖性而拷贝数非依赖性的表达，且组织表达特异性与发育阶段特异性表达模式正确；3)得到7株完整整合的αMⅢ转基因鼠株系，在删除HS-4～40后，人α-类珠蛋白基因在各个发育阶段，红系及非红系不同组织均无表达；4)人α-类珠蛋白基因在转基因鼠中的表达不干扰内源α-类珠蛋白基因的表达水平。 综上结果说明：1)即便是对于含高度重复序列的人α-珠蛋白基因簇，选取适当的同源重组方法也可将其成功修饰，从而得到正确的突变体；2)人α-类珠蛋白基因在转基因鼠中的表达并不干扰内源珠蛋白基因的表达水平，因而以相应时期的鼠内源α-类珠蛋白基因作对照定义人α-类珠蛋白基因的表达水平可保证准确性；3)HS-40以及HS-4～33删除后，人α-类珠蛋白基因仍呈现正确的组织特异性和发育阶段特异性表达，说明人α-类珠蛋白基因正确表达模式的维持至少不依赖于某单一上游调控元件；4) HS-4～40的删除造成人α-类珠蛋白基因的沉默，说明该段序列对于人α-珠蛋白基因簇在转录水平上的正常表达至关重要；5)HS-40核心序列的缺失显著降低了人α-类珠蛋白基因的表达水平，说明HS-40对于人α-类珠蛋白基因在转录水平上的表达具有重要作用，但并非是维持人α-类珠蛋白基因转录表达的唯一元件；6) HS-4～33的大片段DNA序列缺失使人α-珠蛋白基因转录水平上的表达明显下降，但是人ζ-珠蛋白基因仍维持较高的转录水平。说明在这段序列中，存在具有发育阶段特异性的调控作用的元件。 我们的研究结果最终表明，HS-4～33和HS-40对于人α-类珠蛋白基因表达的调控均是有意义的，但又都不足以单独指导人α-珠蛋白基因簇的表达。我们推测：类似于β-珠蛋白基因簇远距离调控元件LCR的成环作用机制，人α-珠蛋白基因簇的上游调控元件HS-4～40也是以成环机制作用于结构基因的启动子，从而完成对人α-类珠蛋白基因在转录水平上的调控，而HS-40和HS-4～33在调控过程中的作用又有不同：HS-40对每个时期的人α-类珠蛋白基因都有重要的增强作用；而HS-4～33则呈现了发育阶段特异性的增强作用，只对胎儿／成年型人α-珠蛋白基因有调控作用，而对胚胎型人ζ-珠蛋白基因没有增强作用，只在HS-40缺失时才会援救其表达。