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链格孢霉变应原的实验研究

曹乃清  
【摘要】: 链格孢霉(Alternaria Alternara Keissler)是一种常见的重要的吸入性过敏原,可诱发过敏性鼻炎和支气管哮喘,为了对敏感者进行特异性诊断和治疗,首先要制备高质量的链格孢霉浸出液,为此本作者对链格孢霉的培养、鉴定、提取、分析以及浸出液的2-DE指纹图谱进行了研究。 为了叙述方便,按以下五部分分别加以介绍: 第一部分:链格孢霉过敏的临床特征及标准血清池的建立 我们对2005年8月至2007年5月期间收集到的55例链格孢霉过敏者进行了临床分析,其年龄从6岁至75岁不等,平均为34±17岁,男性为29例,女性为26例。55例中有43例(78.2%)为支气管哮喘,30例(54.5%)为过敏性鼻炎,18例(33%)为过敏性鼻炎合并有支气管哮喘,这些患者的发病季节多为夏季。 为了进行链格孢霉致敏蛋白的分析,我们从上述55例中选择了20例患者,构建标准血清池。 第二部分:链格孢霉菌种的收集、培养和鉴定 本实验的链格孢霉是从空气曝皿中收获的菌种,然后进行提纯培养,对于后者应用常规的形态学和分子生物学鉴定。 形态学鉴定显示所培养的真菌生长7d后,呈灰黑色至黑色,分生孢子呈倒棒形或卵形。 分子生物学鉴定:为了提高链格孢霉浸出液的制备水平,在必要时需采用分子生物学的办法进行鉴定;本研究应用PCR对所培养真菌的26S rDNA进行扩增后,通过Genebank进行比对,与链格孢霉相似性达99%以上。 通过形态学和分子生物学的鉴定,证明它与链格孢霉有高度一致性。其拉丁文为alternaria alternata Keissler,其标准中文名为链格孢霉或交链格孢或互隔链格孢;本文统一采用链格孢霉。 第三部分:链格孢霉变应原提取方法的研究 为了探索最有效的链格孢霉变应原的提取方法,对新鲜培养的链格孢霉菌苔按4种不同的方法进行提取,分别为研磨器研磨、液氮研磨、研磨器研磨超声破碎、液氮研磨超声破碎(LNU);对所得到的4种浸液应用Bradford法及SDS-PAGE进行分析,并用PAST抑制试验测定变应原活性。 结果显示:不同提取方法提取新鲜培养的链格孢霉菌苔,经LNU所得到的变应原浸液,蛋白质含量最高、蛋白条带最多,在PAST抑制试验中达到50%抑制所需蛋白含量是最低的。据此我们认为在对于链格孢霉来说,LNU是较好的提取方法。 第四部分:SDS-PAGE免疫印迹分析 为了明确链格孢霉变应原浸液的致敏蛋白,本实验通过对LNU法提取的链格孢霉变应原浸液进行免疫印迹分析。 研究结果显示:经SDS-PAGE免疫印迹分析显示,有7条蛋白条带能与链格孢霉特异性IgE结合,分子量分别为92KD、87KD、67KD、53KD、45KD、29KD、22KD;7种致敏蛋白中,有3种主要致敏蛋白,这些蛋白能被一半以上的病人血清所识别,它们的分子量分别为92KD、53KD、22KD。 第五部分:链格孢霉变应原浸液双向电泳的研究 为了解决链格孢霉浸液的鉴定问题,我们还应用双向电泳及免疫印迹的方法分析其致敏蛋白。 结果显示:通过双向电泳发现链格孢霉浸液中有1450±35个蛋白点,经2-DE免疫印迹分析发现有6个免疫活性的蛋白点,由于双向电泳图谱具有高度的特异性,作者建议可将双向电泳作为链格孢霉浸液鉴定的指纹图谱。此项工作有待进一步研究。


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