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全身照射引起小鼠Flk-1~+骨髓间充质干细胞细胞衰老不相关的成骨潜能改变及其与骨骼和造血系统损伤的关系

马杰  
【摘要】: 干细胞存在于机体胚胎及成体的各种组织中,是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体,其中成体干细胞(adult stem cells, ASCs),尤其是间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能支持机体多种组织器官生理性的持续更新过程,并参与疾病或损伤时组织再生和修复。 我们已经成功地从胎儿和成人的多种组织及小鼠骨髓的MSCs培养体系中分离得到Flk1~+MSCs,它们具有稳定的表型特征,即Flk1、CD29、CD44、CD105阳性,内皮细胞特征性表型von Willebrand(vWF)、CD31和造血细胞的表型CD34、CD45、CD11a、CD11b和HLA-DR阴性;能向三个胚层的细胞分化;并且已在多个疾病损伤模型中证实它能参与组织损伤修复。更为重要的是,慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)、再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)、骨髓增殖异常综合征(meylodysplastic syndrom, MDS)患者的骨髓中也含有具有相同表型特征的Flk1~+ MSCs,它们或作为白血病干细胞(leukemia stem cells, LSCs)存在参与CML的发生,或因其分化潜能或免疫调节功能的异常参与疾病进展。以上说明:Flk1~+ MSCs不仅在组织损伤和修复中发挥重要作用,其生物学特性的异常改变可能还是一些疾病发生、发展的干细胞水平的机制。 放射治疗是目前临床上常用的一种肿瘤治疗方法,但它除了能杀灭肿瘤细胞外,也往往损伤正常组织,如骨和骨髓等,导致放射相关的一系列近期和远期并发症。已有报道,放射诱导的造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)衰老是放射后长期骨髓造血功能损伤的潜在机制。但骨髓中不仅含有HSCs,还含有MSCs,它能分化为骨髓基质的多种细胞成分,构成HSCs龛位(niche)。其中由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)分化而来的成骨细胞,不仅参与骨组织的构成,还是HSCs龛位的关键细胞成分。因而我们应用全身照射(total body irradiation,TBI)小鼠模型进行了以下实验,观察TBI对小鼠Flk1~+BMMSCs生物学特性的影响及其意义。 本研究第一部分旨在观察Flk1~+BMMSCs在放射损伤后细胞衰老相关的细胞和分子水平指标的变化。结果显示:在接受单一剂量4Gy的TBI后,小鼠Flk1~+BMMSCs并未表现出细胞衰老相关的形态学、衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)活性的改变以及细胞周期阻滞现象,相反地,TBI后第3天,较多的Flk1~+BMMSCs进入S期。同时,TBI也未能诱导细胞衰老相关基因p16~(INK4a)、p21~(cip1/waf1)、p53和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达上调。 鉴于成骨细胞在骨骼和HSCs龛位中的重要作用,在第二部分的实验中我们研究了TBI对小鼠骨髓间充质干/祖细胞池大小及其成骨分化潜能的影响。4Gy的TBI后,小鼠骨髓间充质干/祖细胞池明显缩小,表现为成纤维细胞集落形成单位(colony-forming unit fibroblast,CFU-F)数量迅速减少,4周内未见恢复。向成骨细胞分化的Flk1~+BMMSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和Von Kossa染色及成骨分化相关基因:核心结合因子1(core-binding factor 1, Cbfa1)、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,Col1)、骨钙蛋白(osteocalcin, OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在TBI前后不同时间点的表达变化均说明Flk1~+BMMSCs的成骨潜能在TBI后第3天明显增强,随后成骨细胞分化、成熟障碍。这一改变可能与BMMSCs上具有PDZ结合基序的转录共激活基因TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)的表达变化相关。 在第三部分的实验中我们观察了TBI后小鼠体内成骨细胞、骨骼系统以及HSCs骨龛(osteoblastic niche)的改变。我们发现,TBI后体内成骨细胞数量显著减少,骨组织结构破坏明显,TBI后第15周时,TBI小鼠全身骨密度(bone mineral density, BMD)明显降低。纺锤形的、表达神经-钙黏附素的成骨细胞(spindle-shaped N-cadherin-expressing osteoblasts, SNOs)被认为是HSCs骨龛中的关键细胞成分,TBI后其数量亦明显减少。 总之,通过以上实验研究,我们证实4Gy TBI不能诱导小鼠Flk1~+BMMSCs发生细胞衰老;但骨髓间充质干/祖细胞池显著缩小;TBI后早期Flk1~+BMMSCs进入S期增多,成骨分化潜能明显增强,随后细胞周期逐渐恢复,成骨分化能力显著降低。TBI诱导的Flk1~+BMMSCs数量、细胞周期状态及成骨潜能的动态改变提示在TBI后早期Flk1~+BMMSCs存在一定的代偿,但最终Flk1~+BMMSCs数量和成骨分化能力的显著降低可能是TBI后骨骼和造血系统长期损伤的干细胞水平的机制。


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