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miRNA在脊髓发育及肿瘤分类中的作用

赵建军  
【摘要】: microRNA(miRNA)是一种大小约21~23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工而成,在线虫、植物、昆虫和哺乳动物都有发现。近年来,随着对miRNA在生物个体发育过程中的基因表达调控作用的认识,使得miRNA的研究倍受关注,并成为当前生命科学理论和应用研究的热点。在理论方面,重点研究miRNA如何通过参与转录后基因表达的调控,在细胞分化、增殖和死亡、发育调控等方面发挥作用;在应用方面,以miRNA为靶向的小分子RNA药物正在成为生物药物开发新热点,而组织特异性miRNA表达谱有可能成为肿瘤诊断、分级、分类与预后的新标志。 一、miRNA在胚胎脊髓发育中作用机制的研究 目的:筛选并鉴定胚胎脊髓组织中特异性miRNA,分析其在脊髓神经细胞分化、增殖和发育过程中的基本功能,为深入研究胚胎神经系统正常发育和畸形形成机制提供基础。 方法:首先应用寡核苷酸芯片技术分析人12孕周和24孕周流产胎儿不同器官的全基因组miRNA表达谱,通过Northern Blot和聚类分析确定脊髓等中枢神经系统特异性miRNA;通过全反式维甲酸(RA)诱导建立大鼠胚胎脊柱裂动物模型,根据大鼠胚胎发育情况,分别在第13.5、15.5、17.5和19.5天取出胚胎,采用miRNA组织细胞原位杂交和Northern Blot等方法检测脊髓发生过程中miRNA的表达情况,分析脊髓组织特异miRNA在神经细胞分化、增殖和发育中的作用。 结果: (1)分别构建了12周和24周人胚心脏、肝、肾、肺、脑、脊髓等组织器官的全基因组miRNA表达谱,结果显示158种人源miRNA的72%-83%在胚胎组织器官中表达,且相同发育阶段的不同组织器官miRNA表达谱不同,而不同发育阶段的相同组织器官,miRNA表达谱也不同;通过聚类分析,首次发现mir-9/9~*仅在人胎儿神经系统中表达,包括大脑和脊髓,以及miR-124a、miR-125b和miR-128等三种与mir-9/9~*协同表达的胚胎神经系统特异miRNA。 (2)在RA诱导的脊柱裂大鼠脊髓细胞凋亡明显增加,表明RA处理可诱导胚胎发育晚期脊髓细胞的非正常死亡;Bcl-2与miR-9/9~*以及P53与miR-124a/125b具有相同的时空表达模式;且运动神经元和背根神经节中miR-124a/125b表达缺失。 结论: (1)本论文在大脑、脊髓等人胚胎神经系统首次发现了独特的miRNA表达谱,提示miRNA在人胚胎大脑和脊髓发育过程中起重要作用。 (2)本论文发现,RA诱导脊髓特异性miRNA表达下调主要为时空表达模式的失调,提示这些miRNA有可能通过RA诱导下调,进而影响脊髓的正常发育或诱导了细胞凋亡;此外,本研究结果还显示miR-9/9~*和miR-124a/125b可能通过调控Bcl-2和P53通路,在感觉和运动神经元发育过程中发挥作用。 二、miRNA用于神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤分类研究 目的:以神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤为对象,筛选并构建肿瘤组织特异性miRNA表达谱,研究其作为肿瘤分级、分类及预后分子标志的可行性。 方法:根据WHO临床分级标准收集新鲜的神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤样本,通过福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)制作组织芯片(TMA),采用miRNA芯片、组织细胞原位杂交(ISH)和Northern Blot等方法确定肿瘤组织miRNA表达特征,采用免疫组织化学方法检测肿瘤相关蛋白标记,包括Ki-67、VEGF和GFAP等在肿瘤组织的定位与表达情况,通过聚类分析构建肿瘤组织miRNA特异性表达谱。 结果: (1)对神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征的研究结果显示,人神经胶质细胞瘤中miR-9和miR-21表达的增加,而miR-124a、miR-125b表达的减少,结合病理诊断,发现组织特异性miRNA表达模式与神经胶质细胞瘤的病理分级相关;此外,miRNA总体表达水平与Ki-67、VEGF以及GFAP标志物之间呈负相关。 (2)对视网膜母细胞瘤组织miRNA表达特征研究结果显示,肿瘤组织基因组miRNA整体表达水平高于正常对照,有11种miRNA表达水平超过正常视网膜组织的2倍(N/T<0.5),其中表达水平高于正常水平4倍的有miR-373*、miR-503和miR-320;该结果与Northern Blot和组织细胞原位杂交结果一致。 结论: (1)根据本论文对神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征的研究结果表明,miRNA是一类不同于现有肿瘤标志物的新型分级、分类标志物,同时结合临床病程、病理诊断以及聚类分析,提示神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征也可用于预后以及放、化疗敏感性或耐药性的判定,并特别提出miR-9、miR-21、miR-124a和miR-125b可能是神经胶质瘤诊断、治疗和预后评估的关键标志物。 (2)在对视网膜母细胞瘤组织miRNA表达特征的研究中,首次发现肿瘤基因组miRNA整体表达水平增高,提示视网膜母细胞瘤的发病机制可能与其他实体瘤不同,其中miR-373*、miR-503和miR-320表达水平远高于其他miRNA,提示其可能是在视网膜母细胞瘤发生、发展中起重要作用的调控分子。


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