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女性高危人群生殖道沙眼衣原体感染的分子流行病学研究

高省  
【摘要】: 生殖道沙眼衣原体(CT)感染是全球最常见的性传播疾病之一。近五年来,在北美、欧洲、东南亚的多个国家和地区,CT感染已上升为所有报告性病的首位。沙眼衣原体侵入人体后,能诱导产生型特异性细胞免疫和体液免疫。但通常免疫力不强,且维持短暂,因而常造成持续感染、隐性感染和反复感染。CT感染后,会出现一系列的临床疾病,例如在男性患者中可出现非淋菌性尿道炎、淋病后尿道炎、附睾炎、前列腺炎等;在女性中会出现子宫颈炎、尿道炎、盆腔炎。此外,由于孕妇感染者可通过产道将沙眼衣原体传播给新生儿,可导致新生儿结膜炎和新生儿肺炎等严重感染。沙眼衣原体感染如不能得到及时诊断和治疗,会产生一系列严重并发症,包括输卵管源性不孕、异位妊娠等。很多研究结果显示,大多数的生殖道CT感染是无症状的隐性感染,或者有一半以上感染者表现为症状非常轻微的亚临床感染,因而往往导致迟发现、延误诊断和治疗,造成严重后果。根据世界卫生组织和多个国家的报告来看,CT的发病率不仅占据了性病的首位,而且有快速上升的趋势。各国对性病综合预防与控制的干预策略,并没有在CT感染控制方面收到预期的效果。根据这些情况,英国开展了全面的CT筛查项目,我国周边的国家和地区,例如日本、泰国、韩国、印度、中国台湾等都进行了以PCR-RFLP外膜蛋白基因分型为基础的CT感染的分子流行病学研究,以寻求新的策略和方法。目前我国的情况是,CT感染在性病监测和上报系统中尚未作为单独的性病进行上报,而是归类在非淋菌性尿道炎(NGU)中一同上报,这对于评估沙眼衣原体的感染率、发病率与疾病负担,以及确定控制措施和评价干预效果等带来了一定的难度。根据最近五年的全国性病疫情分析资料来看,NGU的发病率和构成比都处于性传播疾病的首位。说明我国的CT感染流行也面临着与世界其他国家和地区相同的挑战。然而,在本研究前我国目前尚缺乏完整的沙眼衣原体标准菌株库。为此,本研究课题就国内的实际情况进行了如下研究: 第一章沙眼衣原体标准菌株库的建立和鉴定 通过与美国疾病预防与控制中心性病控制中心合作,以及由中国性病控制中心购买等途径,获得了沙眼衣原体15种基本血清型的标准菌株。根据沙眼衣原体缺乏ATP酶,其所需能量只能依靠其他细胞提供,其为严格的细胞内寄生的原核细胞型微生物这一特性,结合实验室的实际情况和条件,使用McCoy细胞作为标准菌株体外培养的载体细胞,使用含10%小牛血清的1640培养液进行了McCoy细胞的培养、含1‰放线菌酮的沙眼衣原体培养液进行标准菌株的接种、培养和传代、进行了碘染色观察细胞内沙眼衣原体包涵体。并且通过设计特异性引物和巢式PCR引物扩增外膜蛋白基因、限制性内切酶酶切、垂直电泳等实验鉴定各型沙眼衣原体标准菌株,从而在国内建立了较为完整的沙眼衣原体基本血清型标准菌株库。 第二章沙眼衣原体质粒扩增和检测方法的建立 在绝大多数沙眼衣原体中普遍存在着一种隐性质粒(cryptic plasmid),这种质粒DNA约为7.5kb,基因序列非常保守,各型之间变异不到1%。在质粒DNA上有8个开放读码框(open reading frames,ORV),其中有5个ORF是有功能的。在ORF1和ORF8之间有一个高度保守的22kb的连续重复4次的核苷酸序列,CT质粒DNA单向复制的起点就在这段重复序列的附近。在每个沙眼衣原体菌体中的质粒DNA有7~10个拷贝数,而沙眼衣原体主外膜蛋白基因(ompl)只有1个拷贝数。因此,即便在CT的浓度非常低的情况下,也可以较为敏感的扩增出质粒DNA,以满足检测要求。因此针对沙眼衣原体隐性质粒的基因片段进行引物设计、PCR扩增和检测是在ompl基因分型研究之前,确定标本中是否存在沙眼衣原体的最佳方法之一。本研究根据Bass 1993年的研究,结合罗氏Amplicor CT/NG(?)检测试剂盒的说明,设计了CP24和CP27两条针对沙眼衣原体质粒的引物,并且通过对标准菌株、临床标本的试验,成功扩增出207kb的目的片段。 第三章沙眼衣原体主要外膜蛋白基因(ompl)巢式PCR扩增和RFLP检测方法的建立 主要外膜蛋白(又称主外膜蛋白)是沙眼衣原体外膜蛋白的主要成分,分子质量占外膜蛋白的60%,主外膜蛋白有4个可变区(VD)和5个恒定区(CD)。针对主外膜蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体检测方法,将CT分为15个血清型,主外膜蛋白的VD区氨基酸序列的变化由主外膜蛋白基因(ompl)决定。CT各型的ompl基因总长度约为1.1kb左右,各型的长度略有不同。基于ompl基因的PCR-RFLP技术和基因测序等都能便捷的进行大规模样本的CT基因分型的流行病学研究。因此利用ompl基因DNA分型方法,可描述不同型的CT感染在人群、时间和地域上的分布情况。由于ompl基因在CT中是单份拷贝的,相比较质粒PCR扩增而言,扩增难度更大。因此需要敏感性较高的扩增和检测技术。本章主要内容是针对标准菌株和临床标本进行基于ompl基因PCR扩增的DNA提取方法的优化选择、初步PCR和巢式PCR引物设计及筛选、反应体系的建立和反应条件的优化。目的在于提高CT感染标本ompl的扩增敏感性。同时,本课题使用标准菌株质粒PCR的反应体系及ompl基因的反应条件进行标准菌株质粒DNA的扩增,并且取得很好的效果,由此在每步PCR扩增反应中将标准菌株质粒PCR设立为阳性对照。 第四章基于沙眼衣原体基因分型方法的性病淋巴肉芽肿临床病例的诊断 对一例具有性病淋巴肉芽肿(lymphogranuloma venereum,LGV)临床特点的患者进行临床资料的综合分析,包括淋巴结活检、阴道镜检查、Clearview衣原体快速检测,并通过PCR技术扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白ompl的基因,将扩增产物进行AluⅠ酶切,限制性内切酶多态性(RFLP)对沙眼衣原体分型,并对ompl基因的恒定区CD3、CD5,以及可变区VD4进行引物设计、扩增并测序,对感染株进行分型,确定为L3型沙眼衣原体感染。 第五章沙眼衣原体基因分型的临床流行病学研究 通过针对ompl基因PCR-RFLP分型的方法研究国内女性高危人群生殖道CT感染的基因型分布。研究人群包括了性病门诊女性患者和女性工作者(包括羁押和娱乐场所的性工作者),研究地点分布在中国南部的深圳和广州、东部的上海和南京、西南部的成都和南宁六个城市。为了研究男性和女性人群中的衣原体基因型分布差异,在南宁的性病门诊收集女性宫颈标本的同时收集了324份男性尿道拭子标本,结果未发现男性和女性CT感染者中基因型分布的差别。在收集的1770例女性宫颈拭子标本中,共检测出质粒阳性标本240例,其中226例标本的ompl基因成功扩增。在分型结果中,血清型E(n=63,27.9%)、F(n=53,23.5%)、G(n=28,12.4%)和D(n=25,11.1%)最为流行。F型感染与小年龄组和单身婚姻状况的相关性有统计学意义。G型与下腹痛关系密切,47.5%的E型感染者为无症状感染。这些研究结果提供了国内高危女性人群中CT感染型别分布的基本情况,同时结果也表明包括无症状感染在内的这些高危女性人群面临多种型别衣原体感染的潜在风险。尽管样本量有限,但是衣原体型别和临床表现之间的关系也能帮助提供相应的信息。


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