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基因芯片技术筛选原发性干燥综合征唇腺组织异常表达的基因及对部分基因功能的初步探讨

王玉华  
【摘要】: 干燥综合征(Sj(?)gren syndrome,SS)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征为唾液腺和泪腺等外分泌腺淋巴细胞浸润,从而引起口眼干燥等临床表现。此病确切病因及发病机制目前仍尚未明确。研究表明在分子水平,同许多其它疾病一样,干燥综合征的发生、发展是一个多基因调控,多阶段、多步骤的复杂的生物学过程,涉及多种基因的协同作用,若只是孤立的分析某个基因的功能已经难以适应研究的需要。基因芯片技术是近年来新出现的一种具有高通量、高效率、低消耗的分子生物学技术,它能够在同一时间内,通过少量标本,实现生物基因信息的大规模检测,通过比较正常和疾病状态下的基因转录及其表达的差异,寻找和发现与该疾病相关的候选基因,有可能揭示疾病发生过程中的多个作用环节,同时也能为疾病的诊断和治疗提供分子生物学方面的证据。本研究在国内首次应用基因芯片技术研究原发性干燥综合征患者主要靶器官唇腺的基因表达情况,旨在较全面了解干燥综合征疾病过程中基因表达情况,并寻找其中的敏感基因,深入研究干燥综合征的发病机制。 一.应用基因芯片技术筛选原发性干燥综合征与正常对照唇腺组织的差异表达基因 目的:应用基因芯片技术获取原发性干燥综合征患者与正常对照唇腺组织中差异表达基因,并对这些基因的功能进行初步的分析。材料与方法:实验组和正常对照组各3例。将每个唇腺组织单独抽提总RNA,纯化后组内等量混合,分别制成cRNA探针,通过与包括47,000个转录本的Affymetrix人类基因表达谱芯片U133A plus 2.0杂交,经过信号检测、微阵列图像分析、计算机软件数据处理,将所得的数据进行比较,得出两组基因表达的信息,筛选出差异表达基因。根据Gene Ontology对所筛选的部分差异基因进行功能分析。结果:共检出显著差异基因181个,上调表达128个,下调表达53个。其中表达序列标志(expressed sequence taq,EST)19个,余均为全长基因。包括细胞因子及受体,免疫相关基因,信号传导相关基因,转录相关基因,凋亡相关基因,生长分化相关基因,细胞周期相关基因等不同层次、不同功能的基因,尚有11个功能未知基因。结论:基因芯片技术作为一种新兴的生物学技术,具有大规模、高通量、高效率的特点,从而达到高效筛选差异表达基因的目的。通过cDNA芯片,可从全局角度了解SS唇腺基因的表达情况,为筛选SS相关基因及基因治疗研究方面提供了强有力的工具。 二.基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、骨桥蛋白(OPN)和牙本质基质蛋白1(DMP1)在pSS患者和正常对照唇腺组织中的mRNA和蛋白表达情况 目的:从基因芯片筛选出的差异基因中选出OPN和DMP1。研究pSS唇腺中OPN、DMP1与其各自的伴侣分子MMP-3和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平的变化。材料与方法:收集24例pSS和14例正常对照的唇腺活检标本。①提取唇腺组织中总RNA,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增MMP-3、MMP-9、OPN、DMP1、β-actin的基因片断,计算目的基因与β-actin的吸光度比值。②使用MMP-3、MMP-9、OPN、DMP1蛋白的特异抗体,应用免疫组织化学染色方法分析目的基因蛋白在唇腺中的表达情况。③将各组结果进行统计学分析,并与非刺激唾液流率和唇腺淋巴细胞灶性评分进行相关性分析。结果:pSS组唇腺组织中各目的基因的mRNA转录及蛋白表达水平均高于正常对照组(p<0.05)。OPN表达水平与淋巴细胞灶性评分呈正相关。免疫组化结果提示:MMP-3、MMP-9、OPN和DMP1蛋白主要分布在腺上皮细胞胞浆内,但OPN和DMP1在浸润的淋巴细胞胞浆中也有阳性表达。结论:pSS患者唇腺中MMPs表达增加,并可致唇腺结构破坏和功能下降。OPN、DMP1在pSS疾致病过程中的可能致病机理还有待于进一步研究。同时本实验再次证明腺上皮细胞在SS中不只是免疫反应攻击的靶子,它还是炎症迁延慢性化的重要因素,积极地参与SS的发病过程。


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