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百日咳杆菌的免疫蛋白质组学研究以及应用生物信息学方法筛选针对百日咳的新抗原和药物靶点

朱泳璋  
【摘要】: 百日咳是一种由百日咳杆菌传播,侵袭呼吸道并引发急性呼吸道感染的传染病,每年导致35万儿童死亡,感染百日咳的病例数超过4000万,主要都集中在发展中国家。百日咳疫苗是预防百日咳流行和爆发的最有力的手段。自20世纪50年代百日咳全细胞疫苗即菌体疫苗应用以来,已经极大地降低了百日咳的发病率和死亡率。据世界卫生组织报道,实施百日咳菌体疫苗接种已减少了8561。1万个病例与72.6万例儿童死亡。但是由于接种产生的严重副反应,近年来,百日咳全细胞疫苗正逐渐被第二代百日咳疫苗即无细胞疫苗取代。一直到现在,即使百日咳疫苗已经普遍推广,百日咳仍然是公共健康卫生的一个重大威胁,百日咳发病率一直在显著提高。可能的原因包括:1.目前使用的百日咳全细胞疫苗和无细胞疫苗都不能对儿童产生终生免疫,一般3—5年后保护力就逐渐消失;2.副百日咳杆菌也能引起百日咳,不过症状要比百日咳杆菌引起的要轻,而且病症耐受期也要短。当前使用的百日咳疫苗对越来越来多的副百日咳感染者没有保护力或保护力不足。因此需要进一步提高现有百日咳疫苗的保护效力。由于人是百日咳杆菌的唯一宿主,缺乏合适的动物研究模型,百日咳杆菌的致病机理以及导致宿主产生的免疫机制一直还不是完全清楚,极大地限制了发展百日咳新疫苗。当前对百日咳疫苗的研究主要是融合表达多抗原或DNA疫苗等基因工程疫苗,但这些新疫苗的免疫效果都不令人满意。除了疫苗预防外,药物的预防和治疗也是控制百日咳流行的必不可少的手段。到目前为止,百日咳治疗常用的抗生素(主要是大环内酯类抗生素)都或多或少产生一些严重的副作用,尤其对婴幼儿,而且没有一个大环内酯类抗生素被美国FDA批准应用到6个月以下的婴儿身上。因此,现在急需找到针对百日咳杆菌和副百日咳杆菌的疫苗候选抗原和药物靶点。 免疫蛋白质组学技术,融合了抗体识别的特异性和高分辨率能力的2D双向电泳和精确的质谱分析,广泛应用于筛选疫苗抗原、诊断抗原、新型药物和临床标志物等研究。在本研究中,免疫蛋白质组学技术被首次应用鉴定百日咳杆菌的免疫原性蛋白。百日咳杆菌的膜蛋白和胞外分泌蛋白分别用经典的TritonX-114和TCA—丙酮沉淀法制备。免疫印迹使用免疫百日咳全细胞疫苗的儿童血清。MADLI-TOF/MS质谱—共鉴定出了32个免疫原性蛋白,包括27个膜蛋白和11个胞外蛋白。在这些免疫原性蛋白中,69KDa蛋白或粘附素、血清抗性蛋白和外膜孔蛋白是已知的百日咳杆菌重要的毒力因子,其中粘附素还是百日咳无细胞疫苗的重要成分之一;血清抗性蛋白也是百日咳杆菌抵抗宿主机体内补体杀伤作用的决定因素。而编码外膜配体结合蛋白的基因是唯一一个被鉴定出的是Bvg—中间相的基因,Bvg—中间相被认为是百日咳杆菌从体外传播进入到人体内起始粘附过程的一个重要的中间环节。蛋白合成延伸因子Tu/Ts、3-磷酸甘油醛和分子伴侣蛋白GroEL是在许多病原微生物免疫蛋白质组学研究中都被鉴定出具有强免疫原性的标志性蛋白,在本研究中,也被鉴定出来了。乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、异丙基异构酶、青霉素结合蛋白和ATP结合蛋白虽然是首次在百日咳杆菌中被证实具有免疫原性,但是这些免疫原性蛋白已经在其他一个或多个病原微生物的免疫蛋白质组学研究中被鉴定出来了。其他被发现具有免疫原性的蛋白还包括硫酸盐结合蛋白、2-羟基酸脱氢酶、氨基酸周质结合蛋白和假定蛋白BP3575和BP2818等,尤其是假定蛋白BP3575和BP2818,虽然功能未知,但是却具有良好的免疫原性,更值得深入去研究。通过对这些免疫原性蛋白的深入研究有助于更好地了解百日咳杆菌的致病机制以及与宿主的相互作用。为研究新的百日咳疫苗提供一定的理论基础。 除了免疫蛋白质组学研究外,本研究还整合了生物信息学分析、比较基因组杂交数据、基因表达谱和蛋白质相互作用网络来筛选针对百日咳杆菌和副百日咳杆菌的疫苗候选抗原和药物靶点。在百日咳杆菌3436个ORFs中,总共731个基因,包括671个在百日咳杆菌GMT-1菌株和副百日咳杆菌12822菌株都高度表达基因和81个百日咳杆菌GMT-1菌株的37℃表达上调基因,这37℃表达上调基因同时也存在于副百日咳杆菌基因组,这731个基因被筛选出来作为初步的候选抗原。在去掉胞质蛋白、跨膜结构超过4的内膜蛋白、在137株百日咳杆菌和28株副百日咳杆菌中不保守的蛋白以及与宿主高度同源的蛋白后,最后191个抗原被筛选出来作为针对百日咳杆菌和副百日咳杆菌的候选抗原。这191个候选抗原或者具有高度转录水平,或者和细菌毒力与致病性高度相关,而且这些抗原不仅暴露于细菌表面,还在165株百日咳杆菌和副百日咳杆菌中高度保守,在宿主体内没有高度同源蛋白,不会产生交叉反应,损害宿主。在百日咳杆菌和副百日咳杆菌的蛋白质相互作用网络中,从191个候选抗原进一步鉴定出22个高度连接蛋白,这22个蛋白都参与细菌能量或物质代谢等重要过程,为百日咳杆菌和副百日咳杆菌维持基本的生命活动所必需,能作为合适的百日咳治疗药物靶点。对这191个疫苗候选抗原包括22个潜在的药物靶点的研究能加速发展更有效的百日咳新疫苗和药物。


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