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嗜铬细胞瘤SDH基因及缺氧相关因子的研究

周亚茹  
【摘要】: 目的: 嗜铬细胞瘤是引起继发性高血压的重要原因,其发病机制目前还不完全清楚,临床上早期鉴别良、恶性肿瘤尚有困难。随着分子生物学技术的发展,发现线粒体琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)B和D(SDHB和SDHD)基因在嗜铬细胞瘤中存在一定的突变率。我们对北京协和医院63例嗜铬细胞瘤患者进行SDHB、SDHD基因突变检测,以了解SDHB、SDHD基因突变的频率及类型,探讨SDHB、SDHD基因的遗传学改变在早期发现及诊断嗜铬细胞瘤中的意义。 方法: 1、选择北京协和医院内分泌科2003年11月至2006年4月期间确诊的嗜铬细胞瘤患者63例,其中肾上腺嗜铬细胞瘤41例,肾上腺外副神经节瘤22例;63例患者中有家族史的15例。选择20例健康人作为正常对照。对上述63例患者、有家族史的15例患者的22例亲属及20例对照人群分别进行SDHB、SDHD基因突变检测。 2、PCR扩增SDHB、SDHD基因的各外显子区域,采用PCR-SSCP和PCR产物直接测序法,筛查嗜铬细胞瘤患者的SDHB、SDHD基因突变。 结果: 1、63例嗜铬细胞瘤患者中仅有2例发生SDHB基因突变,突变发生率为3.2%(2/63)。发生突变的均为散发性肾上腺外副神经节瘤患者,突变均出现在第7号外显子上。其中1例为错义突变:g.692 G>A,导致氨基酸Arg231His;另1例为缺失移码突变:g.760delT,导致氨基酸Cys254Val,258X。上述2种突变经Medline检索均未见到相关文献报道。 2、63例嗜铬细胞瘤患者中未检测到SDHD基因突变。 结论: 1、本研究在肾上腺外副神经节瘤患者中检测到2种新的SDHB基因突变类型,SDHB基因的突变率为3.2%,未检测到SDHD基因突变。 2、检测SDHB基因突变对于早期筛查肾上腺外副神经节瘤患者可能具有一定意义。 目的: 嗜铬细胞瘤的发病机制尚不明了,目前认为,肿瘤的发生和一个或数个抑癌基因的失活有关。根据经典的Knudson“二次打击”理论,抑癌基因失活的方式是一条等位基因发生突变,另一条发生杂合缺失(Loss of Heterozygosity,LOH),结果导致肿瘤细胞无限制性克隆生长。文献报道SDHB、SDHD基因与嗜铬细胞瘤的发生有关。我们通过检测嗜铬细胞瘤患者1p35-p36(SDHB所属区域)、11q23(SDHD所属区域)是否发生LOH,以及是否存在LOH的频发区,探讨嗜铬细胞瘤可能的分子遗传学发病机制,并寻找鉴别嗜铬细胞瘤良恶性的分子生物学指标。 方法: 1、选择北京协和医院内分泌科2003年11月至2006年4月期间确诊并接受手术治疗的嗜铬细胞瘤患者40例(良性者29例,恶性者11例),进行1p35-p36、11q23 LOH的研究。 2、提取上述患者肿瘤组织和外周血DNA。在SDHB(1p35-p36)、SDHD(11q23)所属区域附近选择微卫星标识位点(1p上选定4个;11q上选定5个),用~(32)P-α-dCTP掺入,扩增肿瘤和相应外周血DNA,扩增产物经6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影检测各位点有无LOH。 LOH判断标准:与对照扩增产物相比,相对应的肿瘤2条等位基因条带中的1条信号消失或信号强度减弱超过50%。 结果: 1、40例嗜铬细胞瘤患者中,有15例检测出SDHB的LOH,1例检测出该区域的微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI),19例未检测到LOH或MSI,5例为无杂合信息者(Non-informative,NI),故SDHB-LOH的发生率为42.9%(15/35)。15例发生SDHB-LOH的嗜铬细胞瘤患者中,10例为肾上腺外副神经节瘤(66.7%,10/15),5例为肾上腺嗜铬细胞瘤(33.3%,5/15),肾上腺外副神经节瘤发生SDHB-LOH者显著高于肾上腺嗜铬细胞瘤(P<0.01)。D1S3669是SDHB-LOH的频发位点。 2、40例嗜铬细胞瘤患者中,有2例发生SDHD-LOH,2例存在MSI,36例未检测出LOH或MSI。SDHD-LOH的发生率为5.0%(2/40)。发生SDHD-LOH的2例患者均属恶性嗜铬细胞瘤,1例位于肝门区,另1例为腹部多发恶性嗜铬细胞瘤。发生SDHD-MSI的2例患者,1例为家族性双侧嗜铬细胞瘤术后复发,另1例为左肾上腺恶性嗜铬细胞瘤。 结论: 1、SDHB-LOH与肾上腺外副神经节瘤相关,因此该区域的LOH可能作为早期筛查肾上腺外副神经节瘤的分子生物学指标。 2、SDHB和SDHD-LOH/MSI的联合检测可能用于早期筛查肾上腺外恶性副神经节瘤患者。 目的 线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)是三羧酸循环中的重要酶,SDH基因的遗传学改变,可使线粒体氧传感通路异常,导致组织缺氧。组织缺氧时,缺氧诱导因子(HIF)通过调节血管内皮生长因子(VEGF)表达,促进新生血管形成,后者与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。本研究通过免疫组织化学方法,检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、HIF-2α,VEGF及VEGF受体(Flt-1、Flk-1)在正常肾上腺髓质和嗜铬细胞瘤组织中的表达,探讨上述指标在SDHB、SDHD基因不同遗传学改变的嗜铬细胞瘤患者中表达水平的差异。 方法 1.选取北京协和医院内分泌科2003年11月至2006年4月期间确诊并经手术病理证实的嗜铬细胞瘤患者40例(男20例,女20例);另取8例正常肾上腺髓质组织作为对照。 2.采用免疫组织化学方法,检测HIF-1α、HIF-2α,VEGF、Flt-1、Flk-1在正常肾上腺髓质及嗜铬细胞瘤组织中的表达,比较上述指标在SDHB、SDHD基因不同遗传学改变者中表达水平的差异,并分析其与肿瘤临床特点的关系。 结果 免疫组化结果显示: 1.在正常肾上腺髓质组织中HIF-1α、HIF-2α不表达或低表达;VEGF及其受体呈低表达。 2.HIF-1α、HIF-2α在嗜铬细胞瘤细胞胞核和胞浆中表达;VEGF、Flt-1、Flk-1在嗜铬细胞瘤细胞胞浆和血管内皮细胞中表达。 3.发生SDHB、SDHD基因突变/LOH/MSI的嗜铬细胞瘤患者,其HIF-1α、HIF-2α、VEGF和Flt-1、Flk-1的蛋白表达均高于无SDHB、SDHD基因改变者。 4.肾上腺外副神经节瘤患者,恶性、肿瘤内部发生缺血坏死的PHEO患者,其HIF-1α、HIF-2α、VEGF和Flt-1、Flk-1蛋白表达水平明显增高。 结论 SDHB、SDHD基因的遗传学改变,可导致线粒体氧传感通路异常,使得HIF-1α、HIF-2α,VEGF和Flt-1、Flk-1表达增加,促进肿瘤血管形成,参与嗜铬细胞瘤的发生。


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