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Aurora-B激酶抑制剂的系统筛选与活性化合物的发现及其分子药理学研究

付达华  
【摘要】: 有丝分裂是生物体最基本的生命活动过程,能将复制的基因组精确地分配到子细胞中,在长期的进化过程中生物体形成了一整套完善的监测机制以确保遗传物质精确地分配到子细胞中。Aurora激酶(极光激酶)是细胞有丝分裂调控网络中的一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,在整个真核生物的进化过程中都极为保守。在有丝分裂分裂过程中,Aurora激酶通过BubR1、Mad2、Cenp-E、histone H3等底物的磷酸化来调节中心体、纺锤体、染色体或者细胞骨架的变化,同时Aurora激酶的活性和定位以及其功能的正常执行也受到其上游调控分子和伙伴分子的调控。最近几年的研究表明,在人的多种肿瘤细胞中出现Aurora激酶家族成员的过表达,这意味着该家族成员可能与肿瘤的发生及发展有着密切的关系,被认为扮演着原癌基因的角色。 本研究选择Aurora激酶为靶标,建立了利用模式生物-基因突变酵母构建了利用微生物发酵液筛选Aurora激酶抑制剂初筛模型,并利用初筛模型筛选了6000份微生物发酵液粗提物和2000个天然与合成化合物,获得了一组筛选阳性菌株。 本研究利用分子生物学方法,从Hela细胞中提取总RNA,再通过RT-PCR及PCR手段,得到Aurora-B编码基因(AURKB)的cDNA,克隆到pMD-18T载体,构建了重组质粒。再将此片断克隆至表达载体pET-20b(+)中,构建重组表达载体,并转化宿主菌-E.Coli BL21。IPTG诱导表达后通过Ni~(2+)柱亲合层析对表达产物进行纯化,获得了高纯度的重组Aurora-B激酶。为构建酶活反应体系的Aurora-B抑制剂筛选模型奠定基础。 本研究还以Aurora-B的晶体结构为基础,采用虚拟筛选方法,对Microbial Natural Products Database进行了筛选。对获得的22个候选化合物用酵母细胞筛选模型Y300和ipl1-321进行筛选后,得到一个阳性化合物Jadomycin B。体外酶学分析证实JB能抑制Aurora-B激酶的活性;Western Blot分析证实histone H3的磷酸化水平受到JB的抑制;计算机辅助Docking model显示JB进入Aurora-B的活性中心并占据ATP所在位置,利用MTT进行了JB及其衍生物抑制——肿瘤细胞的活性研究,构效关系研究表明JB唑酮环上侧链对Jadomycin类的生物活性起决定性作用。 本研究构建了初筛与活性评价,实物筛选与结构虚拟筛选相结合的微生物来源Aurora-B抑制剂的筛选系统。利用这一筛选系统,我们首次发现了微生物产物Jadomycin B的Aurora-B抑制活性,并研究了其构效关系及其抑制肿瘤活性与特点。从而为研发新型天然来源以Aurora-B靶标的抗肿瘤药物奠定了坚实基础。


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